EGFP示踪研究拟态弧菌感染动态过程及菌影的靶向递送特性
发布时间：2021-10-13 03:08
拟态弧菌（Vibrio mimicus）是一种严重危害水产养殖业的病原菌,可引起养殖鱼类腹水病。大量研究表明拟态弧菌可产生黏附素、肠毒素和溶血素等多种毒力因子,但是其感染过程以及宿主主要靶组织尚不清楚。细菌标记技术是使用标记物标记细菌,以实现对目标细菌的识别,从而达到对其定位及示踪的目的。对此,本课题使用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）标记拟态弧菌,通过绿色荧光信号示踪该菌在感染草鱼（Ctenopharyngodon idellus）体内的动态分布,确定其黏附定植与生长繁殖的靶组织,为鱼类腹水病的防控提供科学依据。同时,以p EGFP-N1为模式质粒,巨噬细胞系RAW264.7为APC,对大肠杆菌菌影（Bacterial Ghosts,BG）的装载和靶向递送质粒特性进行验证,为拟态弧菌菌影型基因疫苗的研制奠定基础。本课题具体开展了以下研究工作:1 拟态弧菌的EGFP基因标记及其特性分析将EGFP基因克隆至原核表达载体p BAD24构建重组表达质pBAD24-EGFP,然后电转至拟态弧菌04-14分离菌株的感受态细胞,获...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EGFP基因的PCR扩增和重组表达质粒pBAD24-EGFP的双酶切鉴定M1、M2.DNA分子量标准；1.PCR产物；2.双酶切产物Fig.2-1PCRamplificationofEGFPgeneandenzymedigestionofrecombinantplasmidpBAD24-EGFP
图 2-2 重组质粒 pBAD24-EGFP 在拟态弧菌中表达后的 SDS-PAGE 分析蛋白质分子量标准； 1. pBAD24-EGFP 未诱导；2. pBAD24 诱导；3. pBAD24- EGFP 诱导Fig.2-2 SDS-PAGE analysis of the EGFP expressed in Vm strain 04-14M. protein molecular standard ;1. uninduced pBAD24- EGFP ; 2.induced pBAD24 ;3. pBAD24-EGFP induced with L-Arabinose菌株的荧光信号检测后的标记菌株和野生菌株菌液制备细菌抹片，荧光显微镜观察细菌结果发现标记菌株在荧光视野下可发出明显的绿色荧光，在明视野(图 2-3，B1、B2)；而野生菌株未发出绿色荧光，仅在明视野下有相 2-3，A1、A2)。分别将诱导后的标记菌株和野生菌株菌液过滤、洗涤后，置于流式如图2-4所示，将标记菌株和野生菌株的荧光强度峰值拟合，可发。说明诱导后的标记菌株的荧光信号强度明显高于野生菌株阴性上鉴定试验结果，可以确定EGFP标记的拟态弧菌构建成功。
图 2-2 重组质粒 pBAD24-EGFP 在拟态弧菌中表达后的 SDS-PAGE 分析M. 蛋白质分子量标准； 1. pBAD24-EGFP 未诱导；2. pBAD24 诱导；3. pBAD24- EGFP 诱导Fig.2-2 SDS-PAGE analysis of the EGFP expressed in Vm strain 04-14M. protein molecular standard ;1. uninduced pBAD24- EGFP ; 2.induced pBAD24 ;3. pBAD24-EGFP induced with L-Arabinose.2.2 标记菌株的荧光信号检测取诱导后的标记菌株和野生菌株菌液制备细菌抹片，荧光显微镜观察细菌形光情况。结果发现标记菌株在荧光视野下可发出明显的绿色荧光，在明视野下菌形态 (图 2-3，B1、B2)；而野生菌株未发出绿色荧光，仅在明视野下有相同菌体 (图 2-3，A1、A2)。进一步分别将诱导后的标记菌株和野生菌株菌液过滤、洗涤后，置于流式细测。结果如图2-4所示，将标记菌株和野生菌株的荧光强度峰值拟合，可发现明显右移。说明诱导后的标记菌株的荧光信号强度明显高于野生菌株阴性对照综合以上鉴定试验结果，可以确定EGFP标记的拟态弧菌构建成功。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鲖爱德华菌口服疫苗对斑点鲖的免疫效果[J]. 吴学婧,汪开毓,阳磊,周燕,王二龙,贺扬,陈德芳,耿毅. 水产学报. 2016(03)
[2]嗜水气单胞菌菌蜕系统的构建及其免疫效果研究[J]. 李绍戊,王荻,刘红柏,尹家胜,卢彤岩. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2016(04)
[3]放射性同位素标记药物临床试验的伦理审查[J]. 黄旭,汪秀琴,孙鲁宁. 中国临床药理学杂志. 2016(01)
[4]嗜水气单胞菌在浸泡感染团头鲂的组织动态分布[J]. 陆春云,谢骏,习丙文,梁利国,夏飞,潘良坤. 中国水产科学. 2015(05)
[5]鱼类新型口服疫苗的研究概况[J]. 安伟,肖雨,张明辉,何正侃. 黑龙江畜牧兽医. 2015(17)
[6]南方鲇拟态弧菌的分离、鉴定及其感染的病理损伤[J]. 邓梦玲,韩帅,耿毅,刘丹,汪开毓,陈成,黄小丽,陈德芳. 中国兽医学报. 2015(03)
[7]鱼用疫苗研究进展[J]. 孙恒昌,陈庭金,黄艳,徐劲,余新炳. 热带医学杂志. 2014(12)
[8]华南地区海水养殖鱼类主要弧菌病原的分离与鉴定[J]. 崔婧,范雪亭,刘文竹,李红月,周永灿,王世锋,谢珍玉. 海南大学学报(自然科学版). 2014(03)
[9]细菌菌影作为新型疫苗和递送载体的研究进展[J]. 杨慧,焦红梅. 中国生物工程杂志. 2014(09)
[10]荧光标记技术在生物学和医学研究中的应用[J]. 吴超柱,徐凡,郜炎龙,姜和. 重庆理工大学学报(自然科学). 2014(05)
硕士论文
[1]鸡白痢沙门氏菌菌影（Ghost）疫苗的制备及其免疫效力评价[D]. 田秋丰.黑龙江八一农垦大学 2014
[2]鸡痢疾志贺菌菌壳的制备及其特性研究[D]. 蒋大伟.河南农业大学 2013
[3]应用抗菌肽—超高压制备肺炎克雷伯菌和副猪嗜血杆菌菌影方法的建立[D]. 胡本钢.吉林大学 2012
[4]鮰爱德华氏菌感染黄颡鱼的病理形态学及病原分布研究[D]. 廖雨婷.四川农业大学 2012
[5]以人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕为基础的新型HIV核酸疫苗研究[D]. 温晶.中国人民解放军军事医学科学院 2011
[6]App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究[D]. 孙颖.天津农学院 2011
[7]新城疫（ND）核酸菌蜕疫苗的构建及免疫效果评价[D]. 密金玲.西南大学 2007
本文编号：3433837
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EGFP基因的PCR扩增和重组表达质粒pBAD24-EGFP的双酶切鉴定M1、M2.DNA分子量标准；1.PCR产物；2.双酶切产物Fig.2-1PCRamplificationofEGFPgeneandenzymedigestionofrecombinantplasmidpBAD24-EGFP
图 2-2 重组质粒 pBAD24-EGFP 在拟态弧菌中表达后的 SDS-PAGE 分析蛋白质分子量标准； 1. pBAD24-EGFP 未诱导；2. pBAD24 诱导；3. pBAD24- EGFP 诱导Fig.2-2 SDS-PAGE analysis of the EGFP expressed in Vm strain 04-14M. protein molecular standard ;1. uninduced pBAD24- EGFP ; 2.induced pBAD24 ;3. pBAD24-EGFP induced with L-Arabinose菌株的荧光信号检测后的标记菌株和野生菌株菌液制备细菌抹片，荧光显微镜观察细菌结果发现标记菌株在荧光视野下可发出明显的绿色荧光，在明视野(图 2-3，B1、B2)；而野生菌株未发出绿色荧光，仅在明视野下有相 2-3，A1、A2)。分别将诱导后的标记菌株和野生菌株菌液过滤、洗涤后，置于流式如图2-4所示，将标记菌株和野生菌株的荧光强度峰值拟合，可发。说明诱导后的标记菌株的荧光信号强度明显高于野生菌株阴性上鉴定试验结果，可以确定EGFP标记的拟态弧菌构建成功。
图 2-2 重组质粒 pBAD24-EGFP 在拟态弧菌中表达后的 SDS-PAGE 分析M. 蛋白质分子量标准； 1. pBAD24-EGFP 未诱导；2. pBAD24 诱导；3. pBAD24- EGFP 诱导Fig.2-2 SDS-PAGE analysis of the EGFP expressed in Vm strain 04-14M. protein molecular standard ;1. uninduced pBAD24- EGFP ; 2.induced pBAD24 ;3. pBAD24-EGFP induced with L-Arabinose.2.2 标记菌株的荧光信号检测取诱导后的标记菌株和野生菌株菌液制备细菌抹片，荧光显微镜观察细菌形光情况。结果发现标记菌株在荧光视野下可发出明显的绿色荧光，在明视野下菌形态 (图 2-3，B1、B2)；而野生菌株未发出绿色荧光，仅在明视野下有相同菌体 (图 2-3，A1、A2)。进一步分别将诱导后的标记菌株和野生菌株菌液过滤、洗涤后，置于流式细测。结果如图2-4所示，将标记菌株和野生菌株的荧光强度峰值拟合，可发现明显右移。说明诱导后的标记菌株的荧光信号强度明显高于野生菌株阴性对照综合以上鉴定试验结果，可以确定EGFP标记的拟态弧菌构建成功。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鲖爱德华菌口服疫苗对斑点鲖的免疫效果[J]. 吴学婧,汪开毓,阳磊,周燕,王二龙,贺扬,陈德芳,耿毅. 水产学报. 2016(03)
[2]嗜水气单胞菌菌蜕系统的构建及其免疫效果研究[J]. 李绍戊,王荻,刘红柏,尹家胜,卢彤岩. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2016(04)
[3]放射性同位素标记药物临床试验的伦理审查[J]. 黄旭,汪秀琴,孙鲁宁. 中国临床药理学杂志. 2016(01)
[4]嗜水气单胞菌在浸泡感染团头鲂的组织动态分布[J]. 陆春云,谢骏,习丙文,梁利国,夏飞,潘良坤. 中国水产科学. 2015(05)
[5]鱼类新型口服疫苗的研究概况[J]. 安伟,肖雨,张明辉,何正侃. 黑龙江畜牧兽医. 2015(17)
[6]南方鲇拟态弧菌的分离、鉴定及其感染的病理损伤[J]. 邓梦玲,韩帅,耿毅,刘丹,汪开毓,陈成,黄小丽,陈德芳. 中国兽医学报. 2015(03)
[7]鱼用疫苗研究进展[J]. 孙恒昌,陈庭金,黄艳,徐劲,余新炳. 热带医学杂志. 2014(12)
[8]华南地区海水养殖鱼类主要弧菌病原的分离与鉴定[J]. 崔婧,范雪亭,刘文竹,李红月,周永灿,王世锋,谢珍玉. 海南大学学报(自然科学版). 2014(03)
[9]细菌菌影作为新型疫苗和递送载体的研究进展[J]. 杨慧,焦红梅. 中国生物工程杂志. 2014(09)
[10]荧光标记技术在生物学和医学研究中的应用[J]. 吴超柱,徐凡,郜炎龙,姜和. 重庆理工大学学报(自然科学). 2014(05)
硕士论文
[1]鸡白痢沙门氏菌菌影（Ghost）疫苗的制备及其免疫效力评价[D]. 田秋丰.黑龙江八一农垦大学 2014
[2]鸡痢疾志贺菌菌壳的制备及其特性研究[D]. 蒋大伟.河南农业大学 2013
[3]应用抗菌肽—超高压制备肺炎克雷伯菌和副猪嗜血杆菌菌影方法的建立[D]. 胡本钢.吉林大学 2012
[4]鮰爱德华氏菌感染黄颡鱼的病理形态学及病原分布研究[D]. 廖雨婷.四川农业大学 2012
[5]以人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕为基础的新型HIV核酸疫苗研究[D]. 温晶.中国人民解放军军事医学科学院 2011
[6]App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究[D]. 孙颖.天津农学院 2011
[7]新城疫（ND）核酸菌蜕疫苗的构建及免疫效果评价[D]. 密金玲.西南大学 2007
本文编号：3433837
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