单环刺螠血红蛋白F-I全长cDNA序列克

发布时间：2021-10-13 00:19

　　血红蛋白（Hemoglobin，Hb）是一种具有运载氧、阿片肽、免疫调节、抗菌和镇痛等功能的蛋白。本课题研究表明Hb片段（hemocidins）是机体在先天性免疫中杀死外源微生物的重要因子。单环刺螠（Urechis unicinctus，Uu）隶属于螠虫动物门，是具有重要经济价值的无脊椎动物。其长期生活在海边潮间带泥性底质中，为滤食性动物，直接暴露于各种病原菌及寄生虫等，但其非特异性免疫系统成功地抵御外来入侵，其中Hb可能起重要作用，而目前对Uu Hb的研究没有相关报道。本课题根据Uu同属物种美洲刺螠（Urechis caupo，Uc）Hb F-I完整的cDNA序列（GI:945055），通过3’RACE和5’RACE克隆了Uu Hb F-I的全长cDNA，共780bp。开放阅读框含429bp，翻译为含142个氨基酸残基的成熟肽，命名为UuHb-F-I。预测分子量为15120.67Da，等电点为9.02，其二级结构中含大量α螺旋。为获得UuHb-F-I，构建原核表达系统BL21（DE3）/pET-22b-UuHb-F-I，经IPTG和乳糖诱导表达成功，其中乳糖诱导在37℃、180r/m... 

【文章来源】：华侨大学福建省

【文章页数】：108 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 单环刺螠的研究进展
        1.1.1 单环刺螠的简介
        1.1.2 单环刺螠的生物学研究
    1.2 血红蛋白抗菌的研究进展
        1.2.1 血红蛋白抗菌性的发现
        1.2.2 Hemocidins 在体外抗菌的研究进展
        1.2.3 Hemocidins 在体内抗菌的研究进展
        1.2.4 Hemocidins 的抗菌机制
        1.2.5 展望与应用
    1.3 美洲刺螠血红蛋白 F‐I 的研究概况
        1.3.1 美洲刺螠血红蛋白的特点
        1.3.2 美洲刺螠血红蛋白 F-I 全长 cDNA 序列
        1.3.3 美洲刺螠血红蛋白 F-I 成熟肽序列
    1.4 研究目的与意义
    1.5 研究方法
        1.5.1 3’RACE 介绍
        1.5.2 5’RACE 介绍
        1.5.3 原核表达系统
        1.5.4 重组蛋白亲和层析
        1.5.5 论文结构安排
第2章 单环刺螠血红蛋白 F-I 全长 cDNA 序列的克隆
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验试剂与耗材
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 主要试剂的配制
    2.2 单环刺螠血红蛋白 F‐I 部分 cDNA 序列的克隆
        2.2.1 引物设计
        2.2.2 单环刺螠总 RNA 的提取
        2.2.3 反转录 PCR
        2.2.4 感受态细胞的制备
        2.2.5 纯化 PCR 产物
        2.2.6 构建 T 克隆载体
        2.2.7 T-A 克隆菌落 PCR 验证
        2.2.8 小提质粒 pUM-TA
        2.2.9 双酶切验证及测序
    2.3 3’RACE
        2.3.1 引物设计
        2.3.2 反转录反应
        2.3.3 套式 PCR 反应
        2.3.4 构建 T 克隆载体及验证测序
    2.4 5’RACE
        2.4.1 引物设计
        2.4.2 去磷酸化反应
        2.4.3 “去帽子”反应
        2.4.4 5’RACE Adaptor 的连接
        2.4.5 反转录反应
        2.4.6 Outer PCR 反应
        2.4.7 Inner PCR 反应
        2.4.8 PCR 产物直接测序
    2.5 生物信息学分析
    2.6 结果和分析
        2.6.1 部分 cDNA 序列的克隆
        2.6.2 3’RACE
        2.6.3 5’RACE
        2.6.4 生物信息学分析
    2.7 小结
    2.8 讨论
第3章 UuHb-F-I 成熟肽的原核表达、纯化及复性
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验试剂与耗材
        3.1.2 主要实验仪器
        3.1.3 试剂配制
    3.2 成熟肽原核表达载体的构建
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 UuHb-F-I 成熟肽基因的扩增
        3.2.3 DNA 双酶切
        3.2.4 表达载体 pET-22b-UuHb-F-I 的构建
        3.2.5 重组质粒的鉴定及测序
    3.3 重组蛋白的表达及鉴定
        3.3.1 IPTG 诱导表达
        3.3.2 SDS-PAGE 电泳
        3.3.3 优化 IPTG 诱导条件
        3.3.4 乳糖诱导表达
        3.3.5 优化乳糖诱导表达条件
        3.3.6 Western Blot
    3.4 重组蛋白的纯化及复性
        3.4.1 重组蛋白亲和层析
        3.4.2 重组蛋白的复性
    3.5 结果和分析
        3.5.1 PCR 扩增成熟肽序列
        3.5.2 双酶切 DNA 样品
        3.5.3 重组菌的菌落 PCR 验证
        3.5.4 双酶切验证
        3.5.5 表达质粒测序
        3.5.6 IPTG 诱导重组表达菌
        3.5.7 乳糖诱导表达重组表达菌
        3.5.8 Western Blot
        3.5.9 重组蛋白亲和层析
    3.6 小结
    3.7 讨论
第4章 重组蛋白的抗菌活性试验
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验试剂与耗材
        4.1.2 主要实验仪器
        4.1.3 试剂配制
    4.2 蛋白浓度测定
    4.3 平板法测活菌数
    4.4 抗菌活性试验
    4.5 结果和分析
        4.5.4 蛋白浓度测定
        4.5.5 抗菌试验
    4.6 小结
    4.7 讨论
第5章 结论
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3433590