基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法
发布时间：2021-10-22 09:43
【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫（EHP）荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSUEHP（标准品）,以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSUEHP DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSUEHP)起始模板范围为2.0×101～2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg（x）+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达...
【文章来源】：西南农业学报. 2020,33(06)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
EHP-SSU rDNA基因PCR扩增及重组质粒pMD18-T-SSUEHP的PCR鉴定结果
以EHP的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,可获得与预期目的片段大小一致的特异性条带(图1);重组质粒pMD18-T-SSUEHP经PCR鉴定及测序分析,所得的目的片段序列与GenBank已公布EHP-SSU rDNA基因对应部分序列的同源性为100 %,说明目的基因片段正确插入pMD18-T载体,即重组质粒pMD18-T-SSUEHP构建成功。取阳性克隆菌液提取质粒,测定浓度并转换为拷贝数,重组质粒pMD18-T-SSUEHP浓度为6.83×109拷贝/μl,OD260/OD280为1.96,满足标准品的要求。图3 荧光定量PCR的TaqMan-MGB探针浓度优化结果
荧光定量PCR的TaqMan-MGB探针浓度优化结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]虾类寄生虫病——虾肝肠胞虫研究进展[J]. 段健诚,邓高威,张庆起,高焕. 淮海工学院学报(自然科学版). 2019(03)
[2]TaqMan–MGB探针荧光定量PCR检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌[J]. 童桂香,黎小正,吴祥庆,黄鸾玉,黄光华,韦信贤. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2019(04)
[3]3种虾肝肠胞虫PCR检测方法的应用比较分析[J]. 叶键,许婷,施礼科,陈凡,王力,陈喆,章秋虎,郭水荣. 水产科学. 2019(03)
[4]猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J]. 李晓菲,陈婷,韩薇,孙爱荣,葛晓杰,梁文花,黄艳,王力,王彩宏,魏笑笑,秦立廷. 中国兽医科学. 2019(04)
[5]黏菌素耐药基因mcr-1 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 施开创,尹彦文,温丽霞,屈素洁,王海清,胡杰. 南方农业学报. 2018(07)
[6]新型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测HCV-RNA方法学的建立[J]. 乔斌,李艳,汪明,熊格. 现代检验医学杂志. 2017(05)
[7]检出虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei）的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）群体的体长和体重关系[J]. 刘雅梅,邱亮,程东远,张庆利,万晓媛,黄倢. 渔业科学进展. 2017(04)
[8]舟山地区大棚凡纳滨对虾生长缓慢病因的调查分析[J]. 施慧,许文军,谢建军,王庚申. 中国水产科学. 2017(02)
[9]基于TaqMan MGB探针的黑白轮枝菌检测方法[J]. 郭立新,张祥林,陈先锋,段维军. 植物检疫. 2017(01)
[10]虾肝肠胞虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 骆云慧,石坚,方磊,孟庆珍,张鑫,钱冬. 中国兽医科学. 2016(07)
硕士论文
[1]虾肝肠胞虫的流行病学及其致对虾生长缓慢机理的探索[D]. 程东远.上海海洋大学 2017
本文编号：3450848
【文章来源】：西南农业学报. 2020,33(06)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
EHP-SSU rDNA基因PCR扩增及重组质粒pMD18-T-SSUEHP的PCR鉴定结果
以EHP的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,可获得与预期目的片段大小一致的特异性条带(图1);重组质粒pMD18-T-SSUEHP经PCR鉴定及测序分析,所得的目的片段序列与GenBank已公布EHP-SSU rDNA基因对应部分序列的同源性为100 %,说明目的基因片段正确插入pMD18-T载体,即重组质粒pMD18-T-SSUEHP构建成功。取阳性克隆菌液提取质粒,测定浓度并转换为拷贝数,重组质粒pMD18-T-SSUEHP浓度为6.83×109拷贝/μl,OD260/OD280为1.96,满足标准品的要求。图3 荧光定量PCR的TaqMan-MGB探针浓度优化结果
荧光定量PCR的TaqMan-MGB探针浓度优化结果
【参考文献】：
期刊论文
[1]虾类寄生虫病——虾肝肠胞虫研究进展[J]. 段健诚,邓高威,张庆起,高焕. 淮海工学院学报(自然科学版). 2019(03)
[2]TaqMan–MGB探针荧光定量PCR检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌[J]. 童桂香,黎小正,吴祥庆,黄鸾玉,黄光华,韦信贤. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2019(04)
[3]3种虾肝肠胞虫PCR检测方法的应用比较分析[J]. 叶键,许婷,施礼科,陈凡,王力,陈喆,章秋虎,郭水荣. 水产科学. 2019(03)
[4]猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J]. 李晓菲,陈婷,韩薇,孙爱荣,葛晓杰,梁文花,黄艳,王力,王彩宏,魏笑笑,秦立廷. 中国兽医科学. 2019(04)
[5]黏菌素耐药基因mcr-1 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 施开创,尹彦文,温丽霞,屈素洁,王海清,胡杰. 南方农业学报. 2018(07)
[6]新型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测HCV-RNA方法学的建立[J]. 乔斌,李艳,汪明,熊格. 现代检验医学杂志. 2017(05)
[7]检出虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei）的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）群体的体长和体重关系[J]. 刘雅梅,邱亮,程东远,张庆利,万晓媛,黄倢. 渔业科学进展. 2017(04)
[8]舟山地区大棚凡纳滨对虾生长缓慢病因的调查分析[J]. 施慧,许文军,谢建军,王庚申. 中国水产科学. 2017(02)
[9]基于TaqMan MGB探针的黑白轮枝菌检测方法[J]. 郭立新,张祥林,陈先锋,段维军. 植物检疫. 2017(01)
[10]虾肝肠胞虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 骆云慧,石坚,方磊,孟庆珍,张鑫,钱冬. 中国兽医科学. 2016(07)
硕士论文
[1]虾肝肠胞虫的流行病学及其致对虾生长缓慢机理的探索[D]. 程东远.上海海洋大学 2017
本文编号：3450848
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3450848.html
