杂色鲍维甲酸X受体转录激活系统的构建与配体筛选

发布时间：2021-10-22 12:37

　　维甲酸X受体是核受体超家族的一员,作为配体依赖型转录因子在生物个体发育、细胞分化、新陈代谢和细胞凋亡中发挥重要作用。新近的研究表明,有机锡化合物（如TBT、TPT）导致的腹足类性畸变与RXR密切相关。论文以课题组前期研究克隆的杂色鲍RXR基因序列为基础,构建了杂色鲍RXR转录激活系统,筛选了杂色鲍RXR天然配体和环境配体,并比较了这些化合物对杂色鲍和斑马鱼RXR转录活性影响的差异。研究结果如下:1)论文克隆了杂色鲍RXR的编码区并重组至超表达载体pcDNA3.1（+）,构建了重组超表达载体pcDNA3.1（+）-HdRXR。同时在报告基因pGL3-promoter启动子区重组维甲酸X反应元件（RXRE）,构建了重组报告基因载体pGL3-promoter-RXRE。应用质粒共转染技术将重组表达载体pcDNA3.1（+）-HdRXR和重组报告基因载体pGL3-promoter-RXRE共转染至293FT细胞,构建了杂色鲍RXR转录激活系统。2)采用上述构建的杂色鲍RXR转录激活系统,对杂色鲍RXR的天然配体和环境配体进行了筛选。结果显示,9cRA、TBT和TPT分别在浓度为1×10

【文章来源】：集美大学福建省

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号表
第1章 引言
    1.1 维甲酸X受体概述
    1.2 维甲酸X受体的天然和环境配体
    1.3 转录激活实验
        1.3.1 转录激活实验构建方法
        1.3.2 报告基因的选择
        1.3.3 宿主细胞的选择
    1.4 转录激活实验在环境内分泌干扰物监测中的应用
    1.5 转录激活实验在维甲酸X受体干扰物监测中的应用
    1.6 主要研究内容和技术路线
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究技术路线
第2章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验对象
        2.1.2 实验用细胞株和菌株
        2.1.3 质粒
        2.1.4 试剂盒以及主要试剂
        2.1.5 仪器
        2.1.6 引物
    2.2 实验方法
        2.2.1 重组表达载体pcDNA3.1-HdRXR的构建
        2.2.2 重组表达载体pcDNA3.1-DrRXR的构建
        2.2.3 重组报告基因质粒pGL3-promoter-RXRE的构建
        2.2.4 去内毒素大量抽提质粒
        2.2.5 293FT细胞的培养
        2.2.6 细胞毒性实验
        2.2.7 报告基因实验
        2.2.8 数据处理
第3章 实验结果
    3.1 总RNA提取结果
        3.1.1 杂色鲍总RNA提取结果
        3.1.2 斑马鱼总RNA提取结果
    3.2 RXR开放阅读框（ORF）扩增结果
        3.2.1 杂色鲍RXR（HdRXR）开放阅读框（ORF）扩增
        3.2.2 斑马鱼RXR（DrRXR）开放阅读框（ORF）扩增
    3.3 重组质粒pcDNA3.1-HdRXR的鉴定
        3.3.1 pcDNA3.1-HdRXR质粒图
        3.3.2 pcDNA3.1-HdRXR菌体PCR检测
        3.3.3 pcDNA3.1-HdRXR酶切检测
        3.3.4 pcDNA3.1-HdRXR插入片段测序鉴定
    3.4 重组质粒pcDNA3.1-DrRXR的鉴定
        3.4.1 pcDNA3.1-DrRXR质粒图
        3.4.2 pcDNA3.1-DrRXR菌体PCR检测
        3.4.3 pcDNA3.1-DrRXR酶切检测
        3.4.4 pcDNA3.1-DrRXR插入片段测序鉴定
    3.5 重组质粒pGL3-promoter-RXRE的鉴定
    3.6 杂色鲍RXR配体的筛选
    3.7 斑马鱼RXR配体的筛选
    3.8 不同化合物与杂色鲍和斑马鱼RXR结合的差异
第4章 讨论
    4.1 杂色鲍RXR转录激活系统的构建
        4.1.1 宿主细胞的选择
        4.1.2 内参报告基因的选择
    4.2 杂色鲍RXR的可能配体
    4.3 RXR与化合物的结合具有种属特异性
第5章 结论与展望
致谢
参考文献
在学期间发表的学术论文及研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]Retinoid X receptor activities of source waters in China and their removal efficiencies during drinking water treatment processes[J]. SATYANARAYANAN Senthil Kumaran.  Chinese Science Bulletin. 2012(06)
[2]有机锡通过核受体干扰内分泌的研究进展[J]. 张纪亮,朱文文,熊建利,孙平.  环境科学导刊. 2011(05)
[3]污水处理厂出水维甲酸X受体干扰效应研究[J]. 李剑,孔东东,王子健,马梅.  北京理工大学学报. 2011(02)
[4]Screening of agonistic activities against four nuclear receptors in wastewater treatment plants in Japan using a yeast two-hybrid assay[J]. Daisuke Inoue,Koki Nakama,Kazuko Sawada,Taro Watanabe,Hisae Matsui,Kazunari Sei,Tsuyoshi Nakanishi,Michihiko Ike.  Journal of Environmental Sciences. 2011(01)
[5]利用报告基因试验检测饮用水源水的内分泌干扰活性[J]. 王晓祎,张哲海,胡伟,孙宏,王心如,于红霞.  生态毒理学报. 2009(05)
[6]酵母双杂交技术构建重组维甲酸X受体（RXR）基因酵母[J]. 李剑,饶凯锋,马梅,王子健.  科学通报. 2008(17)
[7]基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立[J]. 陈立敏,吕秋军,Satoshi Inoue,卞广兴,陈振花,温利青.  药学学报. 2006(08)
[8]重组酵母细胞快速筛选环境雌激素系统的建立[J]. 李湘鸣,罗方妮,陈春波.  环境与健康杂志. 2006(02)

博士论文
[1]环境内分泌干扰物重组酵母检测系统的建立[D]. 郑怡文.第二军医大学 2004



本文编号：3451111