CRISPR/Cas9系统介导tyrp1b、chmp7、kank3在斑马鱼中的定点突变
发布时间：2021-11-05 01:27
为探知 tyrp1b、chmp7和konk3三种功能基因在鱼类中的准确作用和对鱼类功能性状的影响,本文以斑马鱼为研究对象,采用CRISPR/Cas9系统介导三种基因的定点突变。设计Cas9靶位点,构建100 ng/μL的Cas9/gRNA显微注射至斑马鱼单细胞期胚胎,采用Nest-PCR,片段测序和T7EI酶切检测各基因的突变效应,并进一步检测F1代突变频率,探讨。试验结果如下：1.通过PCR片段测序和T7EI酶切两种方法来确定tyrp1b、chmp7和kank3三个基因的单一高效靶位点,发现tyrp1b基因的b1靶位点,chmp7基因的t1靶位点,kank3基因的c3靶位点的基因突变非常高效,均可应用于后续繁育工作。2.将100 ng/μL的Cas9/gRNA显微注射,合理控制Cas9/gRNA剂量很重要,过高剂量的Cas9/gRNA会导致鱼群畸形或死亡。3.F0代测序、F1代测序和TA克隆结果表明,Cas9介导的基因突变可随生殖细胞遗传至下一代,表明CRISPR/Cas9系统介导的基因突变具有可遗传性。4.统计各基因突变率,发现cas9介导的tyrp1b突变率达到38.5%-45....
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统结构??
性切割通常发生在鞭位点互补碱基旁的ＰＡＭ序列上游，其特异性由ＰＡＭ区前２０?ｂｐ的??ＲＮＡ－ＤＮＡ区（ＮＣＣ结构）相互作用决定。而Ｃａｓ９的蛋白成分在与ｏｒ民ＮＡ和比ａｃｒＲＮＡ组??成复合体口?１］时，活性核蛋白通过识别并切割对应于ｃｒＲＮＡ序列的ＤＮＡ序列，避免外源??啜菌体或质粒入侵宿主细胞。该系统工作过程如图２所示。??在基因组编辑过程中，ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ的必需部分可Ｗ合并成单链向导ＲＮＡ??（ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，ｇＲＮＡ），连接在基因组中ＰＡＭ序列的后面，与Ｃａｓ９高效作用引起靴位点??（２０?ｂ的产生ＤＮＡ双链断裂。其介导ＤＮＡ双链断裂的过程如下：首先，ｔｒａｃｒＲＮＡ和??ｐｒｅ－ＲＮＡ?ａ打ａｙ被转录；其次，ｔｒａｃｒ民ＮＡ杂交至Ｉｊ?ｐｒｅ－民ＮＡ?ａｒｒａｙ重复序歹ｉｊ上并与Ｃａｓ９结??合在一起形成二聚体，进一步介导ｐｒｅ－ＲＮＡ到成熟ｃｒＲＮＡ；再次，成熟的ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ??二聚体通过ｃｒ民ＮＡ上的巧ａｃｅｒｓ与ＤＮＡ靴序列上的ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ形成异源二聚体；最后，??在?ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ?中，Ｃａｓ９?在靴?ＤＮＡ?的?ＰＡＭ?上游介导产生?Ｄｏｕｂｌｅ?Ｓｔａｒａｎｄ?Ｂｒｅａｋｓ?口２—２４］。??断裂的ＤＮＡ在细胞内通过两种不同的修复系统而发生作用，即非同源末端连接??（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｅｎｄｉｎｇ?ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥ＊！）或同源重组（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，?ＨＲ），而??这两种修复途径均会引入突变。??Ｇｅｎｏｍ把?ｌｏｃｕｓ?——?麵＾?１ＨＨ???Ｉ?ｔ??
已首次使用ＣＲＩＳＰ民技术完成了?ＲＮＡ介导的人类基因组编辑。杜克大学Ｐｒａｔｔ工程学院??的Ｇｅｒｓｂａ浊研究组ＰＳＩ己开始尝试使用ＣＲＩＳＰＲ技术进行基因治疗。作为新兴的基因组??编辑技术，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的相关研究正呈爆发式增长，如图３所示。??１２００????论?１０００??——??妄?国??发８孤?????Ｈ??美?圓??数?６００??－?－．．．．疏???黑柳?１?１??－?２?邮?Ｉ?１０３?■?■■—??２０１１?２０１２?２０１３?２０１４?２０１己??论文发表年化（年）??图３?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统相关研究的论文数目??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?打ｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｒｄａ化ｄ?ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?Ｃ民ＩＳＰＲ／Ｃａｓ?ｓｙｓ化ｍ??基因组编辑技术在水产生物中的研究成果相当显著，而斑马鱼Ｃ〇ａ加０?ｗＷｏ）作为模??式物种，其基因编辑的研究历史最为悠久。２００８年Ｄｏｙｏｎ等Ｐ７印ｊ用ＺＦＮ技术在斑马鱼??体细胞和性细胞中同步打靴Ｗ／基因，同年Ｍｅｎｇ等也采用ＺＦＮ技术对Ａ成基因定向??打靴。２０１１年Ｓａｎｄｅ等Ｐ９诗Ｉｊ用ＴＡＬＥＮ技术对斑马鱼巧相扣和Ａ巧２基因进行靴向实验，??同年化ａｎｇ等口Ｇ］利用ＴＡＬＥＮ技术介导化佩基因打靴。２０１２年中，Ｍｏｏｒｅ等口｜］、Ｃａｄｅ??等［３２］、Ｄ化ｌｅｍ等［３３］逐巧Ｗ?ＴＡＬＥＮ技术检测了特异位点的基因功能。２０１３年Ｎａｎｎａｎ??Ｃｈａｎｇ等［３４蝴用ｃａｓ９技术分别对舰巧＞、护输４和基因进行打靴
【参考文献】：
期刊论文
[1]动物毛色候选基因TYRP1的研究进展[J]. 李丽莎,李祥龙. 河北科技师范学院学报. 2015(04)
[2]CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展[J]. 解莉楠,宋凤艳,张旸. 中国农业科学. 2015(09)
[3]基因组编辑:植物生物技术的机遇与挑战[J]. 程曦,王文义,邱金龙. 生物技术通报. 2015(04)
[4]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞. 遗传. 2013(11)
[5]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[6]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[7]类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）介导的基因组定点修饰技术[J]. 沈延,肖安,黄鹏,王唯晔,朱作言,张博. 遗传. 2013(04)
[8]鲤四种经济性状的微卫星标记分析[J]. 吕伟华,赵元凤,匡友谊,郑先虎,温晓曦,孙效文. 水产学杂志. 2011(04)
[9]TYRP1基因控制动物色素形成的研究进展[J]. 崔嘉,孙守荣,苗鲁旭,席冬梅,何奕多,毛华明,邓卫东. 中国畜牧兽医. 2009(09)
[10]CRISPR及其在原核生物防御系统中的作用[J]. 王菲,罗恩杰. 热带医学杂志. 2008(10)
硕士论文
[1]山羊TYRP1基因序列分析及SNPs研究[D]. 郑会芹.河北农业大学 2010
本文编号：3476795
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统结构??
性切割通常发生在鞭位点互补碱基旁的ＰＡＭ序列上游，其特异性由ＰＡＭ区前２０?ｂｐ的??ＲＮＡ－ＤＮＡ区（ＮＣＣ结构）相互作用决定。而Ｃａｓ９的蛋白成分在与ｏｒ民ＮＡ和比ａｃｒＲＮＡ组??成复合体口?１］时，活性核蛋白通过识别并切割对应于ｃｒＲＮＡ序列的ＤＮＡ序列，避免外源??啜菌体或质粒入侵宿主细胞。该系统工作过程如图２所示。??在基因组编辑过程中，ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ的必需部分可Ｗ合并成单链向导ＲＮＡ??（ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，ｇＲＮＡ），连接在基因组中ＰＡＭ序列的后面，与Ｃａｓ９高效作用引起靴位点??（２０?ｂ的产生ＤＮＡ双链断裂。其介导ＤＮＡ双链断裂的过程如下：首先，ｔｒａｃｒＲＮＡ和??ｐｒｅ－ＲＮＡ?ａ打ａｙ被转录；其次，ｔｒａｃｒ民ＮＡ杂交至Ｉｊ?ｐｒｅ－民ＮＡ?ａｒｒａｙ重复序歹ｉｊ上并与Ｃａｓ９结??合在一起形成二聚体，进一步介导ｐｒｅ－ＲＮＡ到成熟ｃｒＲＮＡ；再次，成熟的ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ??二聚体通过ｃｒ民ＮＡ上的巧ａｃｅｒｓ与ＤＮＡ靴序列上的ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ形成异源二聚体；最后，??在?ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ?中，Ｃａｓ９?在靴?ＤＮＡ?的?ＰＡＭ?上游介导产生?Ｄｏｕｂｌｅ?Ｓｔａｒａｎｄ?Ｂｒｅａｋｓ?口２—２４］。??断裂的ＤＮＡ在细胞内通过两种不同的修复系统而发生作用，即非同源末端连接??（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｅｎｄｉｎｇ?ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥ＊！）或同源重组（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，?ＨＲ），而??这两种修复途径均会引入突变。??Ｇｅｎｏｍ把?ｌｏｃｕｓ?——?麵＾?１ＨＨ???Ｉ?ｔ??
已首次使用ＣＲＩＳＰ民技术完成了?ＲＮＡ介导的人类基因组编辑。杜克大学Ｐｒａｔｔ工程学院??的Ｇｅｒｓｂａ浊研究组ＰＳＩ己开始尝试使用ＣＲＩＳＰＲ技术进行基因治疗。作为新兴的基因组??编辑技术，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的相关研究正呈爆发式增长，如图３所示。??１２００????论?１０００??——??妄?国??发８孤?????Ｈ??美?圓??数?６００??－?－．．．．疏???黑柳?１?１??－?２?邮?Ｉ?１０３?■?■■—??２０１１?２０１２?２０１３?２０１４?２０１己??论文发表年化（年）??图３?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统相关研究的论文数目??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?打ｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｒｄａ化ｄ?ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?Ｃ民ＩＳＰＲ／Ｃａｓ?ｓｙｓ化ｍ??基因组编辑技术在水产生物中的研究成果相当显著，而斑马鱼Ｃ〇ａ加０?ｗＷｏ）作为模??式物种，其基因编辑的研究历史最为悠久。２００８年Ｄｏｙｏｎ等Ｐ７印ｊ用ＺＦＮ技术在斑马鱼??体细胞和性细胞中同步打靴Ｗ／基因，同年Ｍｅｎｇ等也采用ＺＦＮ技术对Ａ成基因定向??打靴。２０１１年Ｓａｎｄｅ等Ｐ９诗Ｉｊ用ＴＡＬＥＮ技术对斑马鱼巧相扣和Ａ巧２基因进行靴向实验，??同年化ａｎｇ等口Ｇ］利用ＴＡＬＥＮ技术介导化佩基因打靴。２０１２年中，Ｍｏｏｒｅ等口｜］、Ｃａｄｅ??等［３２］、Ｄ化ｌｅｍ等［３３］逐巧Ｗ?ＴＡＬＥＮ技术检测了特异位点的基因功能。２０１３年Ｎａｎｎａｎ??Ｃｈａｎｇ等［３４蝴用ｃａｓ９技术分别对舰巧＞、护输４和基因进行打靴
【参考文献】：
期刊论文
[1]动物毛色候选基因TYRP1的研究进展[J]. 李丽莎,李祥龙. 河北科技师范学院学报. 2015(04)
[2]CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展[J]. 解莉楠,宋凤艳,张旸. 中国农业科学. 2015(09)
[3]基因组编辑:植物生物技术的机遇与挑战[J]. 程曦,王文义,邱金龙. 生物技术通报. 2015(04)
[4]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞. 遗传. 2013(11)
[5]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[6]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao. Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[7]类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）介导的基因组定点修饰技术[J]. 沈延,肖安,黄鹏,王唯晔,朱作言,张博. 遗传. 2013(04)
[8]鲤四种经济性状的微卫星标记分析[J]. 吕伟华,赵元凤,匡友谊,郑先虎,温晓曦,孙效文. 水产学杂志. 2011(04)
[9]TYRP1基因控制动物色素形成的研究进展[J]. 崔嘉,孙守荣,苗鲁旭,席冬梅,何奕多,毛华明,邓卫东. 中国畜牧兽医. 2009(09)
[10]CRISPR及其在原核生物防御系统中的作用[J]. 王菲,罗恩杰. 热带医学杂志. 2008(10)
硕士论文
[1]山羊TYRP1基因序列分析及SNPs研究[D]. 郑会芹.河北农业大学 2010
本文编号：3476795
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