草鱼TAB1蛋白的原核重组表达及其抗体制备
发布时间：2021-11-09 01:48
为了制备草鱼重组TAB1蛋白（rCiTAB1）及其特异性抗体,首先以草鱼头肾组织c DNA为模板,PCR扩增Ci TAB1基因全长序列,并依次构建重组克隆质粒p MD19-T-Ci TAB1与重组表达质粒pET-32a-Ci TAB1。该重组表达质粒经0.5 mmol·L-1 IPTG,37℃诱导表达12 h后获得以包涵体形式表达的重组CiTAB1蛋白（rCiTAB1）。然后,采用3种不同方法对包涵体蛋白进行变性,发现与高浓度尿素直接变性法和洗涤后尿素变性法相比,洗涤后梯度尿素变性法处理后的蛋白纯度最好,经透析复性后得到浓度为2 mg·mL-1的r Ci TAB1。最后,将rCiTAB1蛋白与白油佐剂及免疫增强剂混合,室温下混合1.5h乳化成免疫原,3次免疫新西兰大白兔制备兔抗CiTAB1抗体,经间接ELISA方法和免疫琼脂双向扩散试验测得免疫后第33天血清中特异性抗体的效价分别为1∶1 048 576和1∶16。Western blot检测到一条分子量约为72 kDa的特异性条带,表明该抗体能特异性识别r Ci TAB1蛋白。研究结果为后续...
【文章来源】：安徽农业大学学报. 2020,47(02)CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
表达重组质粒p ET-32a-Ci TAB1的PCR与双酶切鉴定
重组质粒p ET-32a-Ci TAB1诱导表达产物的SDS-PAGE分析
图2 重组质粒p ET-32a-Ci TAB1诱导表达产物的SDS-PAGE分析对空质粒pET-32a和鉴定正确的原核表达重组质粒pET-32a-Ci TAB1进行IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析。结果发现空质粒和重组质粒经诱导表达后分别在21 kDa和72 kDa附近出现2条浓染的蛋白条带，分别与预期的标签蛋白与r Ci TAB1蛋白的分子量大小一致，说明重组质粒得到表达。分别取菌液超声破碎后的上清部分和沉淀部分进行10%SDS-PAGE，进一步分析表达产物的性质，结果显示上清部分几乎无蛋白表达，而沉淀部分有大量表达的目的蛋白，表明r Ci TAB1是以包涵体形式表达的。
【参考文献】：
期刊论文
[1]洗涤条件对重组TATm-survivin（T34A）包涵体纯度的影响[J]. 张海毅. 生物化工. 2017(06)
[2]与PRRSV nsp11互作的宿主细胞蛋白鉴定及生物信息学分析[J]. 靳换,李逸,姜楠,周磊,盖新娜,杨汉春,郭鑫. 微生物学通报. 2017(12)
[3]包涵体变复性技术研究进展[J]. 罗莉,李坤,王保成,王明蓉. 中国医药生物技术. 2012(04)
[4]重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 范翠英,冯利兴,樊金玲,果德安,刘璇. 生物技术. 2012(02)
[5]人Cε3-Cε4基因克隆、表达及纯化复性[J]. 刘中成,时海浪,张艳芬,赵丽君,王培莹,常斌,李雨诗. 生物技术通报. 2011(11)
[6]抗TNFα单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究[J]. 杨涛,杨利军,张建林,张悦红,牛勃. 药物生物技术. 2010(06)
[7]包涵体的形成原因及其处理方法[J]. 邝爱丽,陈圆圆,彭志峰,郑鹿平,付仁一,徐雪,郭伦涛,王川庆. 上海畜牧兽医通讯. 2009(01)
博士论文
[1]变性蛋白复性装置研制及包涵体蛋白变性和复性技术研究[D]. 冯延叶.华东理工大学 2013
硕士论文
[1]大黄鱼TAK1基因与其结合蛋白TAB1和TAB2的克隆及功能研究[D]. 鲍诗源.集美大学 2018
[2]改性聚N-异丙基丙烯酰胺协助蛋白质体外复性研究[D]. 金佳钰.浙江大学 2011
[3]GST-LRF融合蛋白纯化及单克隆抗体的制备[D]. 翁伟平.西北农林科技大学 2008
本文编号：3484401
【文章来源】：安徽农业大学学报. 2020,47(02)CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
表达重组质粒p ET-32a-Ci TAB1的PCR与双酶切鉴定
重组质粒p ET-32a-Ci TAB1诱导表达产物的SDS-PAGE分析
图2 重组质粒p ET-32a-Ci TAB1诱导表达产物的SDS-PAGE分析对空质粒pET-32a和鉴定正确的原核表达重组质粒pET-32a-Ci TAB1进行IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析。结果发现空质粒和重组质粒经诱导表达后分别在21 kDa和72 kDa附近出现2条浓染的蛋白条带，分别与预期的标签蛋白与r Ci TAB1蛋白的分子量大小一致，说明重组质粒得到表达。分别取菌液超声破碎后的上清部分和沉淀部分进行10%SDS-PAGE，进一步分析表达产物的性质，结果显示上清部分几乎无蛋白表达，而沉淀部分有大量表达的目的蛋白，表明r Ci TAB1是以包涵体形式表达的。
【参考文献】：
期刊论文
[1]洗涤条件对重组TATm-survivin（T34A）包涵体纯度的影响[J]. 张海毅. 生物化工. 2017(06)
[2]与PRRSV nsp11互作的宿主细胞蛋白鉴定及生物信息学分析[J]. 靳换,李逸,姜楠,周磊,盖新娜,杨汉春,郭鑫. 微生物学通报. 2017(12)
[3]包涵体变复性技术研究进展[J]. 罗莉,李坤,王保成,王明蓉. 中国医药生物技术. 2012(04)
[4]重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 范翠英,冯利兴,樊金玲,果德安,刘璇. 生物技术. 2012(02)
[5]人Cε3-Cε4基因克隆、表达及纯化复性[J]. 刘中成,时海浪,张艳芬,赵丽君,王培莹,常斌,李雨诗. 生物技术通报. 2011(11)
[6]抗TNFα单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究[J]. 杨涛,杨利军,张建林,张悦红,牛勃. 药物生物技术. 2010(06)
[7]包涵体的形成原因及其处理方法[J]. 邝爱丽,陈圆圆,彭志峰,郑鹿平,付仁一,徐雪,郭伦涛,王川庆. 上海畜牧兽医通讯. 2009(01)
博士论文
[1]变性蛋白复性装置研制及包涵体蛋白变性和复性技术研究[D]. 冯延叶.华东理工大学 2013
硕士论文
[1]大黄鱼TAK1基因与其结合蛋白TAB1和TAB2的克隆及功能研究[D]. 鲍诗源.集美大学 2018
[2]改性聚N-异丙基丙烯酰胺协助蛋白质体外复性研究[D]. 金佳钰.浙江大学 2011
[3]GST-LRF融合蛋白纯化及单克隆抗体的制备[D]. 翁伟平.西北农林科技大学 2008
本文编号：3484401
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