斑节对虾细胞周期蛋白家族部分基因的分子克隆及表达分析
发布时间：2021-11-13 22:06
亲虾繁育技术在对虾养殖过程中一直是一个非常重要的限制因素，而通常采用的眼柄切除技术或者捕捞野生亲虾的方法在实际生产活动中存在伤害亲虾或者资金投入过大等问题[1,2]。因此探寻新的亲虾繁育技术势在必行。本实验拟在分子层面，以斑节对虾为模式生物对卵巢发育相关的细胞周期蛋白H，细胞周期蛋白E等基因进行研究，进而为斑节对虾卵巢发育调控机理的研究打下基础。本实验是在实验室通过高通量测序建立的EST文库的基础上,筛选出了几个与卵巢发育相关的细胞周期蛋白EST序列,利用cDNA末端快速扩增技术克隆出全长cDNA序列，并利用实时定量荧光PCR技术对这些发育相关基因在组织分中布，卵巢不同发育时期的表达，以及经过蜕皮抑制激素（MIH）注射后相应的表达情况进行了分析。此外还选取了具有代表性的细胞周期蛋白B进行了重组表达及免疫组化研究。结果如下：1)采用RACE技术克隆得到一条全长1706bp的细胞周期蛋白E基因cDNA序列，并命名为PmcycE。该序列包含132bp的5非编码区（UTR）和311bp的3非编码区以及1263bp的开放阅读框（ORF），可编码420个氨基酸。预测的分子量约为47.91kDa，理...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
标准的细胞周期示意图
不同的周期蛋白与不同的 CDK激酶的结合展现出不同的 CDK激酶活性（图1-2）。哺乳动物细胞分裂过程中，周期蛋白 A 于 G1 期的早期开始表达并积累，在 G1 期/S 期的交界处逐渐达到峰值，此峰值将持续至 G2 期/M 期[35, 36]。周期蛋白 B 则从 G1 期的晚期开始表达积累，于 G2 期的末期达到峰值并持续至 M 期才开始降解[29]。周期蛋白 D、H 在细胞周期中呈现持续表达趋势[37, 38]，周期蛋白 E则与 M 期晚期及 G1 期早期开始表达并一直持续到 G2 期的末期。细胞周期蛋白在酵母中的表达情况与哺乳动物中的类似[23]。
图 2-1 3’端 RACE 扩增原理示意图（详见 TaKaRa 说明书）Fig2-1 sketch map of the 3’RACE (From the specification of TaKaRa)2.3.5.2.1 PCR 扩增在 3’RACE 中，利用 Semi-nested (半巢式) PCR 方法进行扩增反应[86]，首先分别由 cycH-F1、cycE-F1 与 AP（接头引物：Adaptor primer）进行 PCR 对扩反应，所得产物进行 100 倍稀释后，取 1μL作为模板，利用 cycH-F2、cycE-F2 和Adaptor primer 进行 PCR 二次扩增。（1）一扩 PCR 反应体系配方：10×ExTaq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture (2.5 mM)2μL；cycH-F1(cycE-F1)（10μM）1μL；Adaptor primer（10μM）1μL；ExTaq(5U/μL)0.25μL；MgCL21.5μL；cDNA 1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。一扩 PCR 实验的反应程序如下所示：
【参考文献】：
期刊论文
[1]眼柄切除快速诱导甲壳动物生长发育研究进展[J]. 水燕,史永红,徐增洪,周鑫. 广东农业科学. 2013(21)
[2]Cyclin D1与细胞周期调控[J]. 卢梦玲,闫超,赖多,徐汉虹. 生物技术通报. 2011(10)
[3]实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J]. 陈旭,齐凤坤,康立功,李景富. 东北农业大学学报. 2010(08)
[4]大肠杆菌分解代谢产物阻遏效应研究进展[J]. 马婉晴,章珍,刘悦琳,王华忠. 遗传. 2010(06)
[5]切除眼柄对日本囊对虾亲虾摄食、性腺发育及能量转化的影响[J]. 林琼武,张黎黎,吴超,李少菁,苑桂森,胡文平. 厦门大学学报(自然科学版). 2009(06)
[6]乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达[J]. 陈亮,任随周,许玫英,孙国萍. 微生物学通报. 2009(04)
[7]血清素在斑节对虾催熟过程中的作用[J]. 温为庚,黄建华,杨其彬,周发林,陈旭. 南方水产. 2009(01)
[8]Hela细胞MPF对未成熟卵母细胞的体外促成熟作用分析[J]. 彭佑共,杨罗艳. 医学临床研究. 2008(09)
[9]His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用[J]. 王文礼,王云龙,李晨阳,陈小科,刘利锋. 细胞与分子免疫学杂志. 2008(04)
[10]实时荧光定量PCR技术综述[J]. 邓文星,张映. 生物技术通报. 2007(05)
博士论文
[1]中国明对虾免疫等相关基因的克隆、重组表达与功能分析[D]. 张继泉.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2005
硕士论文
[1]细胞周期蛋白生物信息学分析[D]. 万晶.西南交通大学 2012
[2]斑节对虾几种激素和基因与卵巢发育相关性的研究[D]. 周俊.上海海洋大学 2012
本文编号：3493809
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
标准的细胞周期示意图
不同的周期蛋白与不同的 CDK激酶的结合展现出不同的 CDK激酶活性（图1-2）。哺乳动物细胞分裂过程中，周期蛋白 A 于 G1 期的早期开始表达并积累，在 G1 期/S 期的交界处逐渐达到峰值，此峰值将持续至 G2 期/M 期[35, 36]。周期蛋白 B 则从 G1 期的晚期开始表达积累，于 G2 期的末期达到峰值并持续至 M 期才开始降解[29]。周期蛋白 D、H 在细胞周期中呈现持续表达趋势[37, 38]，周期蛋白 E则与 M 期晚期及 G1 期早期开始表达并一直持续到 G2 期的末期。细胞周期蛋白在酵母中的表达情况与哺乳动物中的类似[23]。
图 2-1 3’端 RACE 扩增原理示意图（详见 TaKaRa 说明书）Fig2-1 sketch map of the 3’RACE (From the specification of TaKaRa)2.3.5.2.1 PCR 扩增在 3’RACE 中，利用 Semi-nested (半巢式) PCR 方法进行扩增反应[86]，首先分别由 cycH-F1、cycE-F1 与 AP（接头引物：Adaptor primer）进行 PCR 对扩反应，所得产物进行 100 倍稀释后，取 1μL作为模板，利用 cycH-F2、cycE-F2 和Adaptor primer 进行 PCR 二次扩增。（1）一扩 PCR 反应体系配方：10×ExTaq Buffer 2.5μL；dNTP Mixture (2.5 mM)2μL；cycH-F1(cycE-F1)（10μM）1μL；Adaptor primer（10μM）1μL；ExTaq(5U/μL)0.25μL；MgCL21.5μL；cDNA 1μL；ddH2O 15.75μL；Total 25μL。一扩 PCR 实验的反应程序如下所示：
【参考文献】：
期刊论文
[1]眼柄切除快速诱导甲壳动物生长发育研究进展[J]. 水燕,史永红,徐增洪,周鑫. 广东农业科学. 2013(21)
[2]Cyclin D1与细胞周期调控[J]. 卢梦玲,闫超,赖多,徐汉虹. 生物技术通报. 2011(10)
[3]实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J]. 陈旭,齐凤坤,康立功,李景富. 东北农业大学学报. 2010(08)
[4]大肠杆菌分解代谢产物阻遏效应研究进展[J]. 马婉晴,章珍,刘悦琳,王华忠. 遗传. 2010(06)
[5]切除眼柄对日本囊对虾亲虾摄食、性腺发育及能量转化的影响[J]. 林琼武,张黎黎,吴超,李少菁,苑桂森,胡文平. 厦门大学学报(自然科学版). 2009(06)
[6]乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达[J]. 陈亮,任随周,许玫英,孙国萍. 微生物学通报. 2009(04)
[7]血清素在斑节对虾催熟过程中的作用[J]. 温为庚,黄建华,杨其彬,周发林,陈旭. 南方水产. 2009(01)
[8]Hela细胞MPF对未成熟卵母细胞的体外促成熟作用分析[J]. 彭佑共,杨罗艳. 医学临床研究. 2008(09)
[9]His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用[J]. 王文礼,王云龙,李晨阳,陈小科,刘利锋. 细胞与分子免疫学杂志. 2008(04)
[10]实时荧光定量PCR技术综述[J]. 邓文星,张映. 生物技术通报. 2007(05)
博士论文
[1]中国明对虾免疫等相关基因的克隆、重组表达与功能分析[D]. 张继泉.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2005
硕士论文
[1]细胞周期蛋白生物信息学分析[D]. 万晶.西南交通大学 2012
[2]斑节对虾几种激素和基因与卵巢发育相关性的研究[D]. 周俊.上海海洋大学 2012
本文编号：3493809
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