Ⅲ型分泌系统转位子蛋白EseC影响迟缓爱德华菌胞内生存机制
发布时间：2021-11-28 09:44
迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda,简称E.tarda）感染宿主范围很广,是水产养殖业的重要病原体。它能够在巨噬细胞内生存和繁殖,是其致病的关键。已有研究表明Ⅲ型分泌系统（T3SS）是E.tarda的一个重要毒力因子,EseB、EseC和EseD是T3SS重要的转位子蛋白,其中EseC和EseD可插入宿主细胞膜,EseB则为游离部分。当E.tarda与宿主细胞接触后,EseB、EseC和EseD会迅速组成转运复合物在宿主细胞膜钻孔,可以将E.tarda的效应蛋白输入宿主细胞,影响E.tarda的胞内生存。EseC已被初步证明可影响E.tarda的胞内生存,但其具体机制不完全清楚。本文利用自杀质粒pHM5构建重组自杀质粒,运用同源重组原理,缺失Et.CD株的eseC基因,得到eseC缺失株,并用PCR鉴定。再用pACYC184质粒构建eseC基因的重组质粒,电击导入缺失株中,得到缺失菌株的互补菌株并鉴定。为了探索EseC是否影响E.tarda细胞毒性和感染的细胞凋亡,以不同的MOI野生株,eseC缺失株和互补株分别感染巨噬细胞后,采用CCK-8试剂盒检测巨噬细胞的存活率。...
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＩＩＩ型分泌系统针状结构图［３４】??３４
以Ｅｔ．ＣＤ株为模板，ＰＣＲ扩增ｅｓｅＣ－Ｆｌ片段，将其与ｐＧＭ－Ｔ?ｅａｓｙ载体连??接，转化至尺ｃｏ／／ＤＨ５ｃｔ感受态细胞中，提取重组质粒，将其命名为ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ??质粒，大小为３７８６ｂｐ，并用Ｘｂａｌ和Ｂｇｌ?ＩＩ进行酶切和ＰＣＲ鉴定，结果如图１－１，??从图中可以看出５泳道和６泳道均出现了大小约７７１ｂｐ的条带，与２泳道的??ｅｓｅＣ－Ｆｌ片段的大小相符，最后经测序验证后，确认ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ质粒含ｅｓｅＣ－Ｆｌ??片段。??Ｍ?１?２?３?４?５?８??＿?—：潘［：??图１－１质粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的鉴定??Ｍ：?ＤＬ５０００?１：未酶切质粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ?２：?ｅｓｅＣ－Ｆｌ?片段?３：质粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ?的?Ｘｂａｌ?酶切?４：质粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ??的Ｂｇｌ?ＩＩ酶切５：质粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的Ｘｂａｌ和Ｂｇｌ?ＩＩ双酶切?６：质粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的ＰＣＲ鉴定??２．２?ｐＧＭ－Ｔ－?Ｆ２质粒的鉴定??将上述获得的ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ和ｅｓｅＣ－Ｆ２片段分别用Ｘｂａｌ和ＳｐｈＩ双酶切，并用??回收试剂盒回收后，将两个片段用Ｔ４连接酶连接，转化入￡．ｃ＿ｏ／／ＤＨ５ａ感受态细??胞中，提取重组质粒，将其命名为？〇１＾－仰２，大小约为４４９８５？，并采用８以１１??和ＳｐｈＩ酶切和ＰＣＲ鉴定，结果如图１－２，?６泳道出现大小约为１４８３ｂｐ大小的条??带（ｅｓｅＣ－Ｆｌ＋ｅｓｅＣ?－Ｆ２的片段大小），与目的条带大小相符，且经过ＰＣＲ鉴定后，??７泳道出现了大小约７７１ｂｐ的条带
用Ｂｇｌ?ＩＩ和Ｓａｃ?Ｉ双酶切并回收，并将其与Ｆ１Ｆ２片段连接，将其转化到感受态??Ｅ．ｃｏ／／?ＳＭｌＯ＾ｐｉｒ）中，提取质粒并将其命名为ｐＨＭ－ＦｌＦ２，并用Ｂｇｌ?ＩＩ和ＳｐｈＩ酶??切和ＰＣＲ鉴定，结果如图１－３，４泳道出现了大小约为１４８３ｂｐ大小的条带，艮Ｐ??为ｅｓｅＣ－Ｆ?１和ｅｓｅＣ－Ｆ２的连接片段，且经过ＰＣＲ鉴定后，５泳道出现了大小约７７１ｂｐ??的条带，６泳道出现了?７１２ｂｐ的条带，最后经测序验证后，确认ｐＨＭ－ＦｌＦ２质粒??含ｅｓｅＣ－Ｆ?１片段和ｅｓｅＣ－Ｆ２片段。??Ｍ?１?２?３?４?５?６??馨ｇ｜■碧！修暴■鑽鐵＿鐵戀?６４８４ｂｐ??——１４８３ｂｐ??１０００?Ｉ????７７１ｂｐ??７５０?，?ＴＭ￣７１１ｂ９??５００?ＢＣＪｋ?：：．：??图１－３重组质粒ｐＨＭ５－Ｆ的鉴定??２４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]esaC基因对迟缓爱德华氏菌的毒力及T3SS蛋白分泌的影响[J]. 李杰,莫照兰,茅云翔,王波,杨佳银,邵林. 高技术通讯. 2010(02)
[2]迟缓爱德华菌溶血活化基因缺失候选株的构建[J]. 成静,高大庆. 江苏大学学报(医学版). 2006(05)
[3]迟缓爱德华菌溶血相关基因的测序和初步的功能分析[J]. 高大庆,阚飙,陆承平,刘延清,吴守一. 遗传学报. 2001(12)
本文编号：3524194
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＩＩＩ型分泌系统针状结构图［３４】??３４
以Ｅｔ．ＣＤ株为模板，ＰＣＲ扩增ｅｓｅＣ－Ｆｌ片段，将其与ｐＧＭ－Ｔ?ｅａｓｙ载体连??接，转化至尺ｃｏ／／ＤＨ５ｃｔ感受态细胞中，提取重组质粒，将其命名为ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ??质粒，大小为３７８６ｂｐ，并用Ｘｂａｌ和Ｂｇｌ?ＩＩ进行酶切和ＰＣＲ鉴定，结果如图１－１，??从图中可以看出５泳道和６泳道均出现了大小约７７１ｂｐ的条带，与２泳道的??ｅｓｅＣ－Ｆｌ片段的大小相符，最后经测序验证后，确认ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ质粒含ｅｓｅＣ－Ｆｌ??片段。??Ｍ?１?２?３?４?５?８??＿?—：潘［：??图１－１质粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的鉴定??Ｍ：?ＤＬ５０００?１：未酶切质粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ?２：?ｅｓｅＣ－Ｆｌ?片段?３：质粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ?的?Ｘｂａｌ?酶切?４：质粒?ｐＧＭＴ－Ｆｌ??的Ｂｇｌ?ＩＩ酶切５：质粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的Ｘｂａｌ和Ｂｇｌ?ＩＩ双酶切?６：质粒ｐＧＭＴ－Ｆｌ的ＰＣＲ鉴定??２．２?ｐＧＭ－Ｔ－?Ｆ２质粒的鉴定??将上述获得的ｐＧＭ－Ｔ－Ｆｌ和ｅｓｅＣ－Ｆ２片段分别用Ｘｂａｌ和ＳｐｈＩ双酶切，并用??回收试剂盒回收后，将两个片段用Ｔ４连接酶连接，转化入￡．ｃ＿ｏ／／ＤＨ５ａ感受态细??胞中，提取重组质粒，将其命名为？〇１＾－仰２，大小约为４４９８５？，并采用８以１１??和ＳｐｈＩ酶切和ＰＣＲ鉴定，结果如图１－２，?６泳道出现大小约为１４８３ｂｐ大小的条??带（ｅｓｅＣ－Ｆｌ＋ｅｓｅＣ?－Ｆ２的片段大小），与目的条带大小相符，且经过ＰＣＲ鉴定后，??７泳道出现了大小约７７１ｂｐ的条带
用Ｂｇｌ?ＩＩ和Ｓａｃ?Ｉ双酶切并回收，并将其与Ｆ１Ｆ２片段连接，将其转化到感受态??Ｅ．ｃｏ／／?ＳＭｌＯ＾ｐｉｒ）中，提取质粒并将其命名为ｐＨＭ－ＦｌＦ２，并用Ｂｇｌ?ＩＩ和ＳｐｈＩ酶??切和ＰＣＲ鉴定，结果如图１－３，４泳道出现了大小约为１４８３ｂｐ大小的条带，艮Ｐ??为ｅｓｅＣ－Ｆ?１和ｅｓｅＣ－Ｆ２的连接片段，且经过ＰＣＲ鉴定后，５泳道出现了大小约７７１ｂｐ??的条带，６泳道出现了?７１２ｂｐ的条带，最后经测序验证后，确认ｐＨＭ－ＦｌＦ２质粒??含ｅｓｅＣ－Ｆ?１片段和ｅｓｅＣ－Ｆ２片段。??Ｍ?１?２?３?４?５?６??馨ｇ｜■碧！修暴■鑽鐵＿鐵戀?６４８４ｂｐ??——１４８３ｂｐ??１０００?Ｉ????７７１ｂｐ??７５０?，?ＴＭ￣７１１ｂ９??５００?ＢＣＪｋ?：：．：??图１－３重组质粒ｐＨＭ５－Ｆ的鉴定??２４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]esaC基因对迟缓爱德华氏菌的毒力及T3SS蛋白分泌的影响[J]. 李杰,莫照兰,茅云翔,王波,杨佳银,邵林. 高技术通讯. 2010(02)
[2]迟缓爱德华菌溶血活化基因缺失候选株的构建[J]. 成静,高大庆. 江苏大学学报(医学版). 2006(05)
[3]迟缓爱德华菌溶血相关基因的测序和初步的功能分析[J]. 高大庆,阚飙,陆承平,刘延清,吴守一. 遗传学报. 2001(12)
本文编号：3524194
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