刃天青显色法和Dxr酶抑制剂模型对海洋真菌来源抗弧菌活性物质的高通量筛选

发布时间：2022-02-19 03:43

　　弧菌病是水产养殖业最重要的细菌病之一,其爆发后死亡率高,给我国水产养殖业造成重大经济损失。人们为了防治水产动物弧菌病,大量盲目使用抗生素,使耐药性菌株不断出现,使病害更加难以控制,需要不断地寻找新的、安全的抗菌药物。海洋真菌因其独特生长代谢机制,具有产生大量结构新颖、活性强的化合物的潜力,成为当下国内外学者研究的热点。本研究以筛选抗弧菌的活性化合物为目标,建立刃天青荧光高通量微量显色法,优化刃天青显色法实验条件,并对比平板稀释法,评价了刃天青方法在测定药物对弧菌最低抑菌浓度（MIC）实验中的适用可行性,并实现了对来源于32株海洋真菌的916个初级馏分的活性筛选,具有直观、可靠、灵敏、微量、经济等优点。根据筛选结果和相关文献报道挑出尖刀镰孢菌、白色侧齿霉、黄曲霉三株真菌进行重新发酵,利用正相反相柱层析、TLC、HPLC方法分离出次级馏分,用刃天青显色方法进行活性跟踪,从白色侧齿霉发酵物中分离出对供试弧菌均有抑菌活性的新化合物EngyodontiuminA。萜类化合物及其衍生物是自然界分布最广泛、结构最复杂的一类次生化合物。生物体内的萜类化合物主要有两种生物合成途径：甲羟戊酸途径（meva... 

【文章来源】：厦门大学福建省211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语一览表
第一部分 前言
    1 弧菌病危害及流行特征
        1.1 弧菌病及感染传播途径
        1.2 弧菌形态、分类
        1.3 弧菌的致病机理
        1.4 弧菌病的治疗
    2. 高通量药物筛选技术概述
        2.1 细胞水平药物筛选模型
        2.2 分子水平筛选模型
            2.2.1 萜类及生物合成途径概述
    3 海洋真菌
    4. 本论文立题依据及研究意义
第二部分 材料与方法
    1 实验材料
        1.1 培养基
        1.2 相关溶液的配制
        1.3 工具酶
        1.4 试剂盒
        1.5 相关试剂与药品
        1.6 主要仪器与设备
        1.7 供试海洋真菌及病原菌、质粒及菌种
    2 刃天青高通量筛选抗弧菌活性化合物方法的建立
        2.1 弧菌的培养
        2.2 刃天青筛选方法最适条件的确定
        2.3 环丙沙星及红霉素抗弧菌的最低抑菌浓度的测定
            2.3.1 刃天青法
            2.3.2 平板稀释法
        2.4 刃天青作为显示剂高通量检测海洋真菌天然馏分抗弧菌活性
            2.4.1 海洋真菌初级馏分库的建立
            2.4.2 高通量筛选抗弧菌的活性馏分
            2.4.3 高通量筛选技术参数评价
            2.4.4 海洋真菌天然次级馏分的制备
            2.4.5 次级馏分的筛选及单一化合物MIC及MBC的测定
    3 以Dxr为靶点的新型抗弧菌药物分子水平模型的建立和应用
        3.1 DNA相关实验和方法
            3.1.1 创伤弧菌E1758总基因组的提取E1758
            3.1.2 大肠杆菌感受态的制备
            3.1.3 转化
            3.1.4 小量质粒DNA的提取
            3.1.5 脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶基因克隆及测序
        3.2 His-DXR融合蛋白诱导表达及纯化
            3.2.1 His-DXR融合蛋白的原核表达
            3.2.2 采用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白
            3.2.3 SDS-PAGE
            3.2.4 测定蛋白浓度
            3.2.5 Ni-NTA再生和制备
        3.3 抑制His-DXR酶活性次级馏分的筛选
            3.3.1 还原型辅酶ⅡOD值-浓度线性标准曲线的制作
            3.3.2 1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶(His-DXR)的活性测定
            3.3.3 筛选模型的初步建立
第三部分 实验结果与分析
    1 刃天青高通量筛选抗弧菌活性化合物方法的建立
        1.1 刃天青高通量筛选最适条件的确定
        1.2 环丙沙星及红霉素抗弧菌的最低抑菌浓度的测定
        1.3 刃天青作为显示剂高通量检测海洋真菌天然馏分抗弧菌活性
        1.4 次级馏分的筛选及单一化合物MIC及MBC的测定
    2 以Dxr为靶点的新型抗弧菌药物分子水平模型的建立
        2.1 pET-22b~+-dxr表达载体的构建和鉴定
        2.2 His-DXR融合蛋白的诱导表达及纯化
        2.3 His-DXR蛋白浓度的测定
        2.4 还原型辅酶ⅡOD值-浓度线性标准曲线的制作
        2.5 重组His-DXR的酶活性的测定及NADPH稳定性考察
        2.6 最适酶活反应条件的测定
            2.6.1 缓冲溶液浓度的确定
            2.6.2 体系反应温度的确定
            2.6.3 反应体系pH的确定
            2.6.4 Mg~(2+)加入浓度的确定
            2.6.5 反应体系中DXP加入量的确定
            2.6.6 标准品膦胺霉素及海洋真菌次级馏分酶活抑制实验
第四部分 讨论
    1 刃天青高通量筛选抗弧菌活性化合物方法的建立
    2 以Dxr为靶点的新型抗弧菌药物分子水平模型的建立
    3 本论文的创新之处
第五部分 结论
参考文献
致谢



本文编号：3632149