营养限制条件下ATGL维持草鱼脂肪细胞脂质代谢稳态的转录调控机制研究
发布时间：2022-07-16 20:03
食物匮乏是动物在自然环境中生存面临最大的威胁。脊椎动物为了维持生命以及保障繁殖而进化出脂肪组织,从而将能量以甘油三酯的形式储存于脂滴中。当机体受到营养限制胁迫时,脂肪细胞内甘油三酯被脂肪酶分解为甘油和游离脂肪酸。其中,释放的游离脂肪酸伴随血液循环进入其他组织,通过氧化分解以提供能量来维持生理活动。与哺乳动物相比,鱼类耐饥饿的时间更长。目前,关于营养限制状况下,调控鱼类脂肪细胞启动脂解的分子机制研究还未见报道,而此类研究的缺失,直接限制了养殖鱼类脂质蓄积人工调控技术的发展。基于此,本论文提出以下两个科学问题:1.鱼类脂肪细胞如何响应营养限制而启动脂解过程?2.鱼类脂肪细胞如何在营养限制状况下避免脂解产生的游离脂肪酸毒性作用而维持自身稳态?围绕这两个科学问题,本研究以草鱼为研究对象,运用分子克隆、蛋白纯化、实时荧光定量PCR、免疫荧光、蛋白印迹、脂肪细胞原代培养等技术,对营养限制状况下鱼类脂肪细胞脂解过程的调控网络开展了系统研究,以期为鱼类脂质代谢理论的建立提供一定的基础资料。本文得出以下研究结果和结论:1.ATGL是连接草鱼脂肪细胞脂解与环境营养变化的关键点克隆草鱼中性脂酶ATGL、HS...
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1.脂解及脂解酶的类型
1.2.胞内脂解途径相关脂酶及其调控机制
1.2.1 中性脂肪酶介导的脂解
1.2.2 自噬和酸性脂肪酶介导的脂解
1.2.3 其他脂酶
1.3 脂解代谢产物的分子信号作用
1.3.1 脂解产生的脂肪酸与PPAR信号
1.3.2 脂解产生的脂肪酸与胰岛素信号
1.3.3 脂解产生的DG与PKC信号
1.4 胞内脂酶在鱼类中的研究
1.5 本研究的目标、意义和内容
第二章 草鱼中性脂酶的克隆及其在脂肪细胞营养限制过程中的表达
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试验仪器和试剂
2.1.2 草鱼前体脂肪细胞的分离培养及处理：
2.1.3 中性脂酶基因完整CDS的获得
2.1.3.1 第一链c DNA的合成
2.1.3.2 引物设计
2.1.3.3 PCR扩增
2.1.3.4 PCR产物纯化回收
2.1.3.5 DNA纯化产物连接T载体
2.1.3.6 重组质粒转化感受态细胞以及挑选阳性克隆测序
2.1.4 脂酶序列的生物信息学分析
2.1.5 甘油三酯含量检测
2.1.6 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
2.1.7 Real-time PCR
2.1.8 Western Blot
2.1.9 统计分析
2.2 结果与分析
2.2.1 中性脂酶CDS序列分析
2.2.2 基因结构分析
2.2.3 共线性分析
2.2.4 中性脂酶在草鱼中的组织表达
2.2.5 营养限制促进ATGL的表达
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 草鱼脂肪细胞ATGL的功能研究
3.1 材料与方法
3.1.1 主要仪器
3.1.2 主要试剂
3.1.3 原核表达载体的构建
3.1.4 GB1-6*His-PET-21a(+)-ATGL重组蛋白的诱导表达
3.1.5 pET-21a-PEDF重组蛋白的亲和纯化
3.1.6 草鱼前体脂肪细胞的培养
3.1.7 甘油三酯含量测定
3.1.8 游离脂肪酸含量的测定
3.1.9 甘油含量的测定
3.1.10 Gyk酶活检测
3.1.11 实时定量PCR(RT-PCR)
3.1.12 脂肪细胞免疫荧光
3.1.13 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
3.1.14 数据分析
3.2 结果与分析
3.2.1 ATGL重组蛋白的诱导表达及条件优化
3.2.2 目的蛋白的亲和纯化
3.2.3 脂肪细胞对融合蛋白的吸收
3.2.4 ATGL在草鱼脂肪细胞中的定位
3.2.5 草鱼ATGL促进脂肪细胞甘油三酯的分解
3.2.6 草鱼ATGL促进脂肪细胞脂肪酸β-氧化基因及重新酯化基因的表达
3.2.7 ATGL-PPARγ防止脂肪细胞内质网应激的发生及甘油三酯的过度丢失
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 营养限制条件下ATGL转录调控机制的研究
4.1 材料与方法
4.1.1 主要仪器
4.1.2 主要试剂
4.1.3 Genome walking
4.1.4 草鱼ATGL基因5’侧翼区系列缺失体的构建
4.1.5 生物信息学分析
4.1.6 转录因子结合位点的缺失突变
4.1.7 转录因子PPARα、CREB及 RXRα过表达载体的构建
4.1.8 细胞转染
4.1.9 萤光素酶活性检测
4.1.10 草鱼原代脂肪细胞培养
4.1.11 甘油三酯含量测定
4.1.12 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
4.1.13 实时定量PCR(RT-PCR)
4.1.14 Western Blot
4.1.15 cAMP含量测定
4.1.16 PKA酶活测定
4.1.17 数据分析
4.2 结果与分析
4.2.1 草鱼ATGL基因5’侧翼区系列报告基因质粒的构建
4.2.2 草鱼ATGL基因核心启动子的鉴定
4.2.3 草鱼ATGL基因核心启动子序列转录因子结合位点预测
4.2.4 PPARα和CREB位点是维持草鱼ATGL基因启动子活性的顺式作用元件
4.2.5 cAMP/PKA/CREB调控刺激状态下ATGL的转录
4.2.6 PPARα调控基础状态下ATGL的转录
4.2.7 营养限制条件下cAMP/PKA/CREB参与ATGL的转录调控
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 营养限制条件下CAMP/PKA-ATGL信号通路维持草鱼脂肪细胞脂质稳态的机制研究
5.1 材料与方法
5.1.1 主要仪器
5.1.2 主要试剂
5.1.3 草鱼原代脂肪细胞培养及饥饿处理
5.1.4 草鱼的饲养及在体饥饿
5.1.5 组织学观察
5.1.6 cAMP含量测定
5.1.7 PKA酶活测定
5.1.8 甘油三酯含量测定
5.1.9 游离脂肪酸含量的测定
5.1.10 甘油含量的测定
5.1.11 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
5.1.12 实时定量PCR(RT-PCR)
5.1.13 数据分析
5.2 结果与分析
5.2.1 PPARγ抑制饥饿过程中内质网应激的产生及防止长期饥饿时TG的过度丢失
5.2.2 长期在体营养限制激活ATGL介导的脂解和PPARγ介导的脂肪酸重新酯化
5.3 讨论
5.4 小结
第六章 本研究主要结论、创新点与下一步研究内容
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 下一步研究内容
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鱼ATGL基因的表达及饲喂n-3 HUFAs对其的影响[J]. 吉红,黄吉芹,刘品. 水产学报. 2012(05)
本文编号：3663197
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1.脂解及脂解酶的类型
1.2.胞内脂解途径相关脂酶及其调控机制
1.2.1 中性脂肪酶介导的脂解
1.2.2 自噬和酸性脂肪酶介导的脂解
1.2.3 其他脂酶
1.3 脂解代谢产物的分子信号作用
1.3.1 脂解产生的脂肪酸与PPAR信号
1.3.2 脂解产生的脂肪酸与胰岛素信号
1.3.3 脂解产生的DG与PKC信号
1.4 胞内脂酶在鱼类中的研究
1.5 本研究的目标、意义和内容
第二章 草鱼中性脂酶的克隆及其在脂肪细胞营养限制过程中的表达
2.1 材料与方法
2.1.1 主要试验仪器和试剂
2.1.2 草鱼前体脂肪细胞的分离培养及处理：
2.1.3 中性脂酶基因完整CDS的获得
2.1.3.1 第一链c DNA的合成
2.1.3.2 引物设计
2.1.3.3 PCR扩增
2.1.3.4 PCR产物纯化回收
2.1.3.5 DNA纯化产物连接T载体
2.1.3.6 重组质粒转化感受态细胞以及挑选阳性克隆测序
2.1.4 脂酶序列的生物信息学分析
2.1.5 甘油三酯含量检测
2.1.6 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
2.1.7 Real-time PCR
2.1.8 Western Blot
2.1.9 统计分析
2.2 结果与分析
2.2.1 中性脂酶CDS序列分析
2.2.2 基因结构分析
2.2.3 共线性分析
2.2.4 中性脂酶在草鱼中的组织表达
2.2.5 营养限制促进ATGL的表达
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 草鱼脂肪细胞ATGL的功能研究
3.1 材料与方法
3.1.1 主要仪器
3.1.2 主要试剂
3.1.3 原核表达载体的构建
3.1.4 GB1-6*His-PET-21a(+)-ATGL重组蛋白的诱导表达
3.1.5 pET-21a-PEDF重组蛋白的亲和纯化
3.1.6 草鱼前体脂肪细胞的培养
3.1.7 甘油三酯含量测定
3.1.8 游离脂肪酸含量的测定
3.1.9 甘油含量的测定
3.1.10 Gyk酶活检测
3.1.11 实时定量PCR(RT-PCR)
3.1.12 脂肪细胞免疫荧光
3.1.13 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
3.1.14 数据分析
3.2 结果与分析
3.2.1 ATGL重组蛋白的诱导表达及条件优化
3.2.2 目的蛋白的亲和纯化
3.2.3 脂肪细胞对融合蛋白的吸收
3.2.4 ATGL在草鱼脂肪细胞中的定位
3.2.5 草鱼ATGL促进脂肪细胞甘油三酯的分解
3.2.6 草鱼ATGL促进脂肪细胞脂肪酸β-氧化基因及重新酯化基因的表达
3.2.7 ATGL-PPARγ防止脂肪细胞内质网应激的发生及甘油三酯的过度丢失
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 营养限制条件下ATGL转录调控机制的研究
4.1 材料与方法
4.1.1 主要仪器
4.1.2 主要试剂
4.1.3 Genome walking
4.1.4 草鱼ATGL基因5’侧翼区系列缺失体的构建
4.1.5 生物信息学分析
4.1.6 转录因子结合位点的缺失突变
4.1.7 转录因子PPARα、CREB及 RXRα过表达载体的构建
4.1.8 细胞转染
4.1.9 萤光素酶活性检测
4.1.10 草鱼原代脂肪细胞培养
4.1.11 甘油三酯含量测定
4.1.12 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
4.1.13 实时定量PCR(RT-PCR)
4.1.14 Western Blot
4.1.15 cAMP含量测定
4.1.16 PKA酶活测定
4.1.17 数据分析
4.2 结果与分析
4.2.1 草鱼ATGL基因5’侧翼区系列报告基因质粒的构建
4.2.2 草鱼ATGL基因核心启动子的鉴定
4.2.3 草鱼ATGL基因核心启动子序列转录因子结合位点预测
4.2.4 PPARα和CREB位点是维持草鱼ATGL基因启动子活性的顺式作用元件
4.2.5 cAMP/PKA/CREB调控刺激状态下ATGL的转录
4.2.6 PPARα调控基础状态下ATGL的转录
4.2.7 营养限制条件下cAMP/PKA/CREB参与ATGL的转录调控
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 营养限制条件下CAMP/PKA-ATGL信号通路维持草鱼脂肪细胞脂质稳态的机制研究
5.1 材料与方法
5.1.1 主要仪器
5.1.2 主要试剂
5.1.3 草鱼原代脂肪细胞培养及饥饿处理
5.1.4 草鱼的饲养及在体饥饿
5.1.5 组织学观察
5.1.6 cAMP含量测定
5.1.7 PKA酶活测定
5.1.8 甘油三酯含量测定
5.1.9 游离脂肪酸含量的测定
5.1.10 甘油含量的测定
5.1.11 脂肪细胞脂滴及细胞核染色
5.1.12 实时定量PCR(RT-PCR)
5.1.13 数据分析
5.2 结果与分析
5.2.1 PPARγ抑制饥饿过程中内质网应激的产生及防止长期饥饿时TG的过度丢失
5.2.2 长期在体营养限制激活ATGL介导的脂解和PPARγ介导的脂肪酸重新酯化
5.3 讨论
5.4 小结
第六章 本研究主要结论、创新点与下一步研究内容
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 下一步研究内容
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鱼ATGL基因的表达及饲喂n-3 HUFAs对其的影响[J]. 吉红,黄吉芹,刘品. 水产学报. 2012(05)
本文编号：3663197
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3663197.html
