利用酵母双杂交技术研究青鳉Prmt5的互作蛋白

发布时间：2022-07-29 11:48

　　Prmt5作为第二类精氨酸甲基转移酶,在基因表达调控、RNA加工、细胞生长分化及信号转导等方面发挥重要作用。本研究以青鳉为实验材料,通过酵母双杂交cDNA文库扫描技术筛选Prmt5的互作蛋白,并对相互作用功能结构域进行了初步探讨。首先以青鳉组织cDNA为模板扩增prmt5全长1905 bp,构建诱饵载体pGBKT7-prmt5。将其转入酵母AH109和Y187细胞后,检测到诱饵蛋白对报告基因无自激活能力,对宿主细胞也无毒性。其次,采用SMARTTM技术构建青鳉鱼苗的酵母双杂交cDNA文库,并对文库进行扩增和大规模转化。文库质量鉴定结果显示,合成的cDNA呈弥散状,大小分布于100～3000 bp范围内。初级cDNA文库库容量约为1.4×106 cfu,插入片段大小在0.5～3.0kb之间,平均插入片段约为1 kb,重组率为100%。结果说明文库cDNA片段多样性良好,长度适合双杂交筛选。再次,将含pGBKT7-prmt5的Y187细胞和含cDNA文库的AH109细胞进行杂交,通过SD/-His-Leu-Trp-Ade四缺营养平板和X-α-gal显色筛选阳性菌。将初步筛选的69个克隆经过... 

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 甲基化
        1.1.1 甲基化概述
        1.1.2 精氨酸甲基化酶家族研究进展
    1.2 Prmt5的研究进展
    1.3 酵母双杂交技术
        1.3.1 酵母双杂交技术概述
        1.3.2 MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3的作用机制
    1.4 青鳉——鱼类模式生物
    1.5 本研究的目的及意义
2. 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 菌株及质粒
        2.1.3 引物序列
    2.2 主要仪器设备
    2.3 主要试剂及试剂盒
        2.3.1 主要试剂及试剂盒
        2.3.2 主要溶液配制
    2.4 实验方法
        2.4.1 实验材料的获取
        2.4.2 目的基因的扩增
        2.4.3 重组质粒的制备
        2.4.4 诱饵载体的自激活及毒性检测
        2.4.5 酵母双杂交cDNA文库的建立
        2.4.6 酵母双杂交cDNA文库的扩增及质量鉴定
        2.4.7 cDNA文库质粒大规模转化AH109酵母菌株
        2.4.8 文库宿主菌和诱饵菌株杂交
        2.4.9 阳性克隆的筛选及鉴定
        2.4.10 回交实验
3. 结果与分析
    3.1 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-prmt5的自激活及毒性检测
        3.1.1 目的基因prmt5的克隆及诱饵载体的构建
        3.1.2 确认酵母菌株Y187和AH109的表型
        3.1.3 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-prmt5的自激活检测
        3.1.4 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-prmt5的毒性检测
    3.2 青鳉鱼苗酵母双杂交cDNA文库的构建、扩增及质量鉴定
        3.2.1 青鳉鱼苗酵母双杂交cDNA文库的构建
        3.2.2 cDNA文库的质量鉴定
    3.3 酵母双杂交文库筛选结果
        3.3.1 阳性克隆的筛选及鉴定
        3.3.2 同源比对结果
    3.4 青鳉Prmt5、Mep50及Prdm1a/Prdm1b的互作
        3.4.1 青鳉Prmt5、Prdm1a/Prdm1b及Mep50互作关系的验证
        3.4.2 青鳉Prdm1a-Mep50和Prdm1b-Mep50相互作用位点探究
4. 讨论
    4.1 青鳉鱼苗酵母双杂交cDNA文库构建及筛库结果分析
    4.2 青鳉Prmt5、Mep50及Prdm1a/Prdm1b互作关系分析
    4.3 结论与展望
参考文献
攻读学位期间发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA甲基化与癌症[J]. 韩竞男,鲁昊骋,梁静.  中国生物化学与分子生物学报. 2012(02)



本文编号：3666408