马氏珠母贝collagen Ⅵ（COLⅥ）基因的克隆和功能研究

发布时间：2022-08-11 10:52

　　Collagen Ⅵ（COLⅥ）是胶原蛋白家族的重要成员,广泛分布于动物体细胞外基质,在脊椎动物骨骼形成过程发挥重要作用。根据本课题组前期建立的马氏珠母贝贝壳基质蛋白数据库,筛选出六个在贝壳含量较高的COLⅥ蛋白。为了探究COLⅥ在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本实验运用聚合酶链式反应（PCR）和cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得COLⅥ基因的cDNA全长,利用荧光定量PCR技术检测基因的表达量分布,并采用原位杂交技术对COLⅥ进行精确定位。通过RNAi技术促使基因表达沉默,探究COLⅥ对贝壳结晶的影响。并利用原核表达技术获得了Pm COLⅥA4-1的重组蛋白。1.本实验成功克隆得到COLⅥ基因Pm COLⅥA4-1、Pm COLⅥA6-1、Pm COLⅥA6-2的cDNA全长。Pm COLⅥA4-1序列全长3136bp,其中开放阅读框（ORF）长2841bp,编码946个氨基酸,5’非翻译区（5’UTR）长93bp,3’非翻译区（3’UTR）长202bp。Pm COLⅥA6-1序列全长2100bp,其中开放阅读框（ORF）长1875bp,编码624个氨基酸,5’非翻译区（5’UT... 

【文章页数】：108 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 生物矿化
    1.2 软体动物贝壳基质蛋白
        1.2.1 珍珠层特有基质蛋白
        1.2.2 棱柱层特有基质蛋白
        1.2.3 珍珠层和棱柱层共有基质蛋白
    1.3 胶原蛋白
        1.3.1 纤维胶原
        1.3.2 FACITs
        1.3.3 网状胶原蛋白
        1.3.4 跨膜胶原蛋白
        1.3.5 血管内皮抑制素前体胶原蛋白
        1.3.6 其他胶原蛋白
    1.4 参与矿化的胶原蛋白
    1.5 COLⅥ基因的研究意义
2 马氏珠母贝COLⅥ基因的克隆和生物学信息分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
            2.1.1.1 实验动物
            2.1.1.2 实验试剂
            2.1.1.3 实验仪器
            2.1.1.4 引物
        2.1.2 实验方法
            2.1.2.1 总RNA的提取
            2.1.2.2 cDNA第一链的合成
            2.1.2.3 基因片段的克隆
            2.1.2.4 基因的非编码区克隆（RACE）
            2.1.2.5 5’调控区的克隆
    2.2 实验结果
        2.2.1 目标基因的筛选
        2.2.2 马氏珠母贝COLⅥ基因的克隆
            2.2.2.1 PmCOLⅥA3基因的克隆
            2.2.2.2 PmCOLⅥA4基因的克隆
            2.2.2.3 PmCOLⅥA5基因的克隆
            2.2.2.4 PmCOLⅥA6基因的克隆
            2.2.2.5 PmCOLⅥA6-1 的基因结构和 5’调控区克隆
        2.2.3 马氏珠母贝COLⅥs的生物学信息分析
            2.2.3.1 PmCOLⅥA3的氨基酸序列特征
            2.2.3.2 PmCOLⅥA4的氨基酸序列特征
            2.2.3.3 PmCOLⅥA5的氨基酸序列特征
            2.2.3.4 PmCOLⅥ6A的氨基酸序列特征
            2.2.3.5 马氏珠母贝COLⅥ蛋白的结构域分析
            2.2.3.6 马氏珠母贝COLⅥ蛋白的空间结构预测
            2.2.3.7 马氏珠母贝COLⅥ的多序列比对
    2.3 讨论
3 COLⅥ在马氏珠母贝不同组织的表达模式和精细定位
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
            3.1.1.1 实验动物
            3.1.1.2 实验试剂
            3.1.1.3 实验仪器
            3.1.1.4 引物
        3.1.2 实验方法
            3.1.2.1 荧光定量PCR实验
            3.1.2.2 原位杂交实验
    3.2 实验结果
        3.2.1 COLⅥ在马氏珠母贝中的表达模式
        3.2.2 COLⅥ在马氏珠母贝外套膜的定位
    3.3 讨论
4 马氏珠母贝COLⅥ的功能研究
    4.1 实验材料与方法
        4.1.1 实验材料
            4.1.1.1 实验动物
            4.1.1.2 实验试剂
            4.1.1.3 实验仪器
            4.1.1.4 引物
        4.1.2 实验方法
            4.1.2.1 双链RNAi探针的制备
            4.1.2.2 RNAi探针的注射
            4.1.2.3 RNAi实验效果的检测
    4.2 实验结果
        4.2.1 RNAi探针的制备
        4.2.2 荧光定量PCR检测RNAi探针的沉默效果
        4.2.3 COLⅥ基因沉默后的贝壳超微结构的变化
    4.3 讨论
5 PmCOLⅥA4重组蛋白的表达
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
            5.1.1.1 实验试剂
            5.1.1.2 实验仪器
        5.1.2 实验方法
            5.1.2.1 pET30- PmCOLⅥA4重组载体的构建
            5.1.2.2 PmCOLⅥA4重组蛋白的诱导表达
            5.1.2.3 PmCOLⅥA4重组蛋白的纯化
    5.2 实验结果
        5.2.1 pET30a- PmCOLⅥA4-1 重组质粒的构建
        5.2.2 PmCOLⅥA4-1 蛋白的诱导表达
        5.2.3 PmCOLⅥA4-1 蛋白的扩大培养
        5.2.4 PmCOLⅥA4-1 蛋白的纯化
        5.2.5 Western blotting检测
    5.3 讨论
6 结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
导师简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]Matrilin家族的研究进展[J]. 麦俊妮,陈婵婵,凌均棨.  国际口腔医学杂志. 2009(06)
[2]X型胶原蛋白与骨骼生长发育关系的研究进展[J]. 郑谦,张筱薇.  国外医学.口腔医学分册. 2002(02)

博士论文
[1]ACCBP对无定形碳酸钙形成与转化调控机制的研究[D]. 苏境坦.清华大学 2013

硕士论文
[1]马氏珠母贝珍珠层基质蛋白基因的克隆与功能研究[D]. 董冰冰.广东海洋大学 2015
[2]大珠母贝金属硫蛋白cDNA序列克隆与表达研究[D]. 唐仁生.华中农业大学 2009



本文编号：3674524