IHNV N和G基因在杆状病毒表达系统中的表达及抗体制备

发布时间：2022-08-23 13:35

　　本研究以某渔场病鱼组织内分离得到的传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）BJLL株为材料，进行了该病毒的实验室培养、鉴定及其某些生物学特性研究，在此基础上，制备了鼠抗IHNV多克隆抗体，克隆表达了IHNV的核蛋白（N）和糖蛋白（G），并对两种蛋白进行Western-Blot和IFA检测，以表达出的IHNV N蛋白作为免疫原，免疫小鼠制备抗血清，并对其进行效价测定等应用。结果如下： 1、IHNV病毒的增殖纯化和多抗制备 利用对IHNV敏感的大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系（CHSE）增殖病毒；测定了培养液中的病毒滴度和病毒在CHSE细胞中的生长曲线；采用超速离心法对收获的病毒进行了纯化；利用纯化的IHNV病毒免疫小鼠制备多克隆抗体，间接ELISA法检测表明获得的鼠抗IHNV血清效价为1:8000。 2、IHNV N蛋白的表达纯化及抗原性分析 参照GenBank已发表的IHNV的WRAC株N基因序列，以分离得到的IHNV毒株（BJLL株）为实验材料，提取RNA，反转录为cDNA，将N基因克隆到pGM-T载体上，对重组质粒进行PCR鉴定和序列测定。结果表明，扩增N基因片段的长度为... 

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Summary
第一章 文献综述
    1 文献综述
        1.1 传染性造血器官坏死病概况
            1.1.1 IHNV 的发现、分布及危害
            1.1.2 IHNV 的病原学特征
            1.1.3 IHNV 基因组特征
            1.1.4 IHNV 疾病表现
            1.1.5 鱼弹状病毒的先天免疫反应
            1.1.6 鱼弹状病毒体液免疫反应
        1.2 杆状病毒表达系统研究进展
            1.2.1 杆状病毒表达系统简介
            1.2.2 杆状病毒表达系统特点
            1.2.3 宿主昆虫细胞培养条件
            1.2.4 杆状病毒表达影响因素
        1.3 目的意义和研究内容
第二章 IHNV 的纯化及抗血清制备
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 病毒、细胞和实验动物
            1.1.2 试剂与培养液
            1.1.3 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 细胞和病毒的体外培养
            1.2.2 RT-PCR 及扩增产物检测
            1.2.3 病毒滴度（TCID50）测定
            1.2.4 病毒生长曲线的测定
            1.2.5 病毒的超离和纯化
            1.2.6 抗 IHNV 鼠血清的制备
            1.2.7 抗 IHNV 病毒血清效价的测定
    2 结果
        2.1 IHNV 的增殖及纯化
        2.2 RT-PCR 检测
        2.3 病毒生长曲线测定
        2.4 小鼠抗 IHNV 血清效价的测定
    3 讨论
    4 小结
第三章 IHNV 核蛋白（N）表达、纯化和抗体制备
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 载体与菌株
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 Sf9 细胞培养相关试剂
            1.1.4 培养基
            1.1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂
            1.1.6 免疫荧光检测（IFA）试剂
            1.1.7 免疫印迹试验（Western-blot）试剂
            1.1.8 蛋白纯化试验试剂
            1.1.9 主要器材
        1.2 实验方法
            1.2.1 pMD-N 质粒构建
            1.2.2 杆状病毒表达载体的构建
            1.2.3 pFB-N-BAC 的构建
            1.2.4 重组病毒的获得
            1.2.5 蛋白的表达纯化与检测
    2 结果与分析
        2.1 引物扩增结果
        2.2 pFB-N-BAC 阳性克隆鉴定
        2.3 IFA 鉴定结果
        2.4 Western-blot 鉴定结果
        2.5 N 蛋白的纯化
        2.6 蛋白质浓度测定
        2.7 IHNV N 蛋白抗血清与全病毒反应
    3 讨论
        3.1 成功构建 N 蛋白杆状病毒表达载体
        3.2 重组蛋白的表达与鉴定
    4 小结
第四章 IHNV G 基因杆状病毒表达系统载体的构建及表达鉴定
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 载体与菌株
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 Sf9 细胞培养相关试剂
            1.1.4 培养基
            1.1.5 免疫荧光检测（IFA）试剂
            1.1.6 免疫印迹试验（Western-blot）试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 IHNV G 基因克隆
            1.2.2 杆状病毒表达载体的构建
            1.2.3 pFB-G-BAC 的构建
            1.2.4 重组病毒的获得
            1.2.5 蛋白的表达与检测
    2 结果与分析
        2.1 引物扩增结果
        2.2 pFB-G -BAC 阳性克隆鉴定
        2.3 重组蛋白的生物学鉴定
            2.3.1 IFA 鉴定结果
            2.3.2 Western-blot 鉴定结果
    3 讨论
        3.1 Sf9 细胞的转染
        3.2 重组蛋白的表达与鉴定
    4 小结
全文结论
参考文献
致谢
个人简介
导师简介



本文编号：3677858