鲤疱疹病毒II型微载体培养技术与灭活疫苗浸泡免疫效果研究

发布时间：2022-11-05 15:38

　　鲫（Carassius auratus）是我国重要的淡水养殖品种之一,在我国水产养殖业中占有重要地位。鲫造血器官坏死症是目前危害养殖鲫最为严重的病毒性疾病,其病原为鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）。鲫造血器官坏死症流行范围广、传染性强,死亡率高,给鲫养殖业造成了重大经济损失。目前,鲫造血器官坏死症尚缺乏有效的防控和治疗方法。疫苗免疫被认为是预防水产养殖动物传染性疾病特别是病毒性疾病最为有效的方法。鲤疱疹病毒II型细胞疫苗制备主要以细胞瓶贴壁方式培养病毒,是疫苗规模化生产的瓶颈因素,探索鲫脑组织细胞（GiCB）与鲤疱疹病毒II型规模化培养工艺具有潜在的应用前景。本论文针对鲤疱疹病毒II型细胞疫苗规模化制备与应用过程中存在的关键工艺问题,开展了鲫脑组织细胞与鲤疱疹病毒II型微载体培养技术及其灭活疫苗浸泡免疫效果的研究,旨在为鲫造血器官坏死症的有效防控提供新的技术途径。本论文主要研究内容如下:1、研究了在Cephodex微载体悬浮培养系统中规模化培养鲫脑组织细胞和鲤疱疹病毒II型的工艺。结果表明,Cephodex微载体适合GiCB细胞的贴壁培养,... 

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要 ABSTRACT 第一章 文献综述
1 鲤疱疹病毒II型研究进展
    1.1 鲫养殖现状
    1.2 鲫造血器官坏死症的临床症状及其流行病学研究
    
1.2.1 鲫造血器官坏死症的临床症状
    
1.2.2 鲫造血器官坏死症的流行病学研究
    
    1.2.2.1 流行区域
    
    1.2.2.2 宿主范围
    
    1.2.2.3 传播方式
    
    1.2.2.4 流行季节
    1.3 鲤疱疹病毒II型的理化和生物学特性
    1.4 鲤疱疹病毒II型的诊断技术
    
1.4.1 电镜诊断技术
    
1.4.2 细胞培养分离法
    
1.4.3 分子生物学诊断技术
    1.5 鲫造血器官坏死症的防治措施
    
1.5.1 药物防治
    
1.5.2 免疫预防
    
1.5.3 生态防控
2 微载体培养技术研究进展
    2.1 微载体培养的发明与发展
    2.2 微载体的分类与特点
    2.3 微载体培养的问题与展望
3 渔用疫苗的研究
    3.1 渔用疫苗的发展
    3.2 疫苗的分类
    3.3 疫苗的免疫途径
    
3.3.1 注射免疫
    
3.3.2 浸泡免疫
    
3.3.3 口服免疫
4 本论文研究的目的及意义 第二章 鲫脑组织细胞与鲤疱疹病毒II型微载体规模化培养工艺研究
1 材料与方法
    1.1 实验材料
    
1.1.1 细胞与病毒
    
1.1.2 实验试剂
    
1.1.3 实验仪器与设备
    1.2 试验方法
    
1.2.1 种子细胞与病毒培养
    
1.2.2 Cephodex微载体预处理
    
1.2.3 微载体培养GiCB细胞
    
1.2.4 最适间歇搅拌条件的确定
    
1.2.5 血清浓度对CIK细胞贴壁的影响
    
1.2.6 最适微载体用量的确定
    
1.2.7 最适细胞接种浓度的确定
    
1.2.8 最适搅拌速度的确定
    
1.2.9 细胞形态观察与计数
    
1.2.10 病毒感染及电镜观察
    
1.2.11 病毒增殖曲线的测定
    
1.2.12 实验数据的统计与分析
2 结果与分析
    2.1 GiCB细胞静置培养的形态及病变效应
    2.2 最适间歇搅拌条件的确定
    2.3 血清的浓度对GiCB细胞贴壁的影响
    2.4 微载体浓度对细胞生长的影响
    2.5 接种密度对GiCB细胞生长的影响
    2.6 搅拌速度对GiCB细胞生长的影响
    2.7 GiCB细胞在Cephodex微载体上的形态观察
    2.8 病毒感染与电镜观察
    2.9 病毒滴度测定结果
    2.10 病毒增殖曲线测定
3 讨论 第三章 CYHV-2 微载体细胞培养灭活疫苗浸泡免疫异育银鲫效果研究
1 材料与方法
    1.1 实验材料
    
1.1.1 试验鱼及饲养条件
    
1.1.2 病毒及细胞系
    
1.1.3 实验试剂
    
1.1.4 实验仪器与设备
    
1.1.5 引物设计
    1.2 实验方法
    
1.2.1 微载体细胞培养灭活疫苗的制备
    
1.2.2 疫苗的无菌检验与安全性检测
    
1.2.3 浸泡免疫
    
1.2.4 Real-time PCR检测免疫相关基因表达量
    
1.2.5 攻毒感染实验
    
    1.2.5.1 免疫4周后攻毒感染实验
    
    1.2.5.2 免疫8周后攻毒感染实验
    
1.2.6 实验鱼体病毒检测
    
1.2.7 实验鱼体病毒载量测定
    1.3 实验数据的统计与分析
2 结果与分析
    2.1 疫苗的无菌检验与安全性检验
    2.2 C3、IL-11 和IgM基因的表达量变化
    2.3 免疫保护效果
    
2.3.1 免疫4周后攻毒感染实验
    
2.3.2 免疫8周后攻毒感染实验
    2.4 PCR病毒检测结果
    2.5 免疫鱼病毒载量测定
3 讨论 结论 参考文献 附录一 附录二 致谢 主要试剂配制


【参考文献】：
期刊论文
[1]鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法[J]. 周勇,范玉顶,徐进,马杰,江南,刘文枝,曾令兵.  淡水渔业. 2017(01)
[2]鲤疱疹病毒Ⅱ型对异育银鲫背鳍细胞的显微形态与免疫基因表达水平的影响[J]. 夏思瑶,王浩,Patorida Podok,许丹,姜有声,吕利群,佐野元彦.  水产学报. 2016(12)
[3]鲤疱疹病毒2型ORF5截短基因的克隆表达及免疫原性研究[J]. 廖红,林华,郝中香,佘容,陈世界,杨苗,陈珍容,薛昌华,赵珊,韩国全,曹三杰,颜其贵.  中国兽医科学. 2016(11)
[4]鲫造血器官坏死症的防控策略[J]. 曾令兵,张治平,马杰,刘文枝.  科学养鱼. 2016(09)
[5]鲤疱疹Ⅱ型病毒（CyHV-2）感染对异育银鲫（Carassius auratus gibelio）组织器官的损伤作用[J]. 林秀秀,叶元土,吴萍,腾峰,王敏,蒋蓉,段荣会,许凡,陈卓,高李松,刘进,蔡春芳.  基因组学与应用生物学. 2016(03)
[6]鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生[J]. 马杰,周勇,范玉顶,刘文枝,江南,曾令兵.  水产学报. 2016(03)
[7]急性病毒性鲫鳃出血病的病理变化[J]. 方进,邓院生,王俊,李涛,陈中元,周莉,张奇亚.  中国水产科学. 2016(02)
[8]一种基于Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72的免疫学检测方法[J]. 孔善云,姜有声,许丹,谢骏,吕利群.  中国水产科学. 2016(02)
[9]鲤疱疹病毒2型微滴式数字PCR快速检测方法的建立[J]. 郝中香,林华,佘容,廖红,陈世界,杨苗,薛昌华,赵珊,韩国全,颜其贵.  中国兽医科学. 2016(02)
[10]聚六亚甲基胍对异育银鲫的急性毒性试验[J]. 俞军,孙琪,胡鲲,杨先乐.  渔业致富指南. 2015(09)



本文编号：3702874