金钱鱼促性腺激素基因的克
发布时间：2023-01-08 16:40
在脊椎动物中,性腺的发育和配子的形成及成熟主要受脑或下丘脑-垂体-性腺轴（BPG＆HPG）的调节。脊椎动物下丘脑分泌的促性腺激素释放激素,使垂体分泌促性腺激素（gonadotropin hormones,GtH）,即促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）和促黄体生成素（luteinizing hormone,LH）作用于性腺,诱导并调控配子的形成。硬骨鱼类中,FSH和LH对生殖调控功能的实现依赖于跟它们的受体相结合,启动下游信号传导通路以及激活相关蛋白并诱导性激素的合成并且作用于配子的成熟及排放。本文以实验室暂养的金钱鱼（Scatophagus argus）为研究对象,运用基因克隆技术、原核表达系统、组织学方法、实时定量荧光PCR、酶联免疫测定（ELISA）,对金钱鱼的促性腺激素基因进行克隆与序列分析、原核表达重组载体的构建、重组蛋白的获得及利用、注射和投喂处理后相关基因的表达、以及血清中性类固醇类激素含量的变化进行了研究及分析。本研究相关结果如下:（1）目的基因的克隆:设计引物并利用基因克隆技术克隆金钱鱼LH和FSH的cDNA全长序列的克隆。金...
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文献综述
1.1 下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）的简介
1.2 LH和FSH的生理结构及功能
1.3 LH和FSH的生物合成及作用机理
1.4 LH和FSH在硬骨鱼类中的研究进展
1.5 硬骨鱼类中AMH，StAR，17β-HSD及E2，11-kT的研究
1.6 研究内容
1.7 技术路线
第二章 金钱鱼促性腺激素基因全长的cDNA克隆
2.1 实验材料
2.1.1 实验用鱼
2.1.2 试剂
2.1.2.1 主要试剂
2.1.2.2 相关试剂的配制
2.1.3 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 组织取材
2.2.2 总RNA提取
2.2.3 模板cDNA的制备
2.2.4 引物设计
2.2.5 金钱鱼GtH全长的RACE克隆
2.2.5.1 模板cDNA的 3’RACE
2.2.5.2 模板cDNA的 5’RACE
2.2.5.3 金钱鱼GtH中间片段的克隆扩增
2.2.5.4 目的基因的连接，转化
2.2.5.5 阳性克隆菌的筛选
2.2.6 金钱鱼GtH的全长序列分析
2.3 结果
第三章 金钱鱼促性腺激素重组蛋白的原核表达及纯化
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 重组质粒r-SaGtH的构建
3.2.1.1 目的基因GtH的扩增
3.2.1.2 克隆载体pEasy-T1-GtH的构建
3.2.1.3 载体质粒pEasy-T1-GtH的提取
3.2.2 重组蛋白r-SaGtH的诱导表达及纯化
3.2.2.1 重组蛋白r-SaGtH的粗提
3.2.2.2 重组融合蛋白r-SaGtH的纯化
3.2.2.3 重组蛋白r-SaGtH的Western Blot检测
3.3 结果
第四章 金钱鱼促性腺激素重组蛋白功能的初步验证
4.1 实验材料
4.1.1 实验用鱼
4.1.2 主要试剂、仪器
4.2 实验方法
4.2.1 重组蛋白r-SaGtH的注射和投喂实验
4.2.1.1 重组蛋白r-SaGtH的注射实验
4.2.1.2 重组蛋白r-SaGtH的投喂实验
4.2.2 青鱂性腺的组织学切片观察
4.2.2.1 青鱂性腺的石蜡切片
4.2.2.2 青鱂性腺的H&E染色
4.2.3 金钱鱼性腺的扫描电子显微镜观察
4.2.3.1 扫描电子显微镜观察中主要试剂的配制
4.2.3.1.1 固定液Karnovsky溶液的配制方法
4.2.3.1.2 磷酸盐缓冲液PB溶液的配制方法
4.2.3.2 扫描电子显微镜观察上机样品的制备
4.2.4 金钱鱼性腺成熟部分相关基因的表达分析
4.2.5 金钱鱼性腺成熟部分相关激素的测定
4.3 结果
4.3.1 青鱂性腺的组织学切片观察
4.3.2 金钱鱼性腺的扫描电子显微镜观察
4.3.3 金钱鱼性腺成熟相关基因的表达分析
4.3.3.1 金钱鱼促性腺激素受体（SaGtHR）的表达分析
4.3.3.2 金钱鱼生殖轴部分下游基因（Amh，Star，17β-hsd）的表达分析
4.3.4 金钱鱼性腺成熟部分相关激素的测定
第五章 小结和讨论
参考文献
附录
硕士期间科研成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性[J]. 柳学周,徐永江,廖梅杰,潘传燕,王妍妍. 中国水产科学. 2013(01)
[2]金钱鱼繁殖生物学及诱导产卵试验[J]. 蔡泽平,王毅,胡家玮,张俊彬,林岳光. 热带海洋学报. 2010(05)
[3]Fish germ cells[J]. XU HongYan1, LI MingYou1, GUI JianFang2 ＆ HONG YunHan1,2 1Department of Biological Sciences, National University of Singapore, Singapore 119260, Singapore; 2 State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China. Science China（Life Sciences）. 2010(04)
[4]金钱鱼生物学研究及回顾[J]. 兰国宝,阎冰,廖思明,罗砚,谢若痴. 水产科学. 2005(07)
[5]促性腺激素释放激素（GnRH）结构与功能及其受体的进化发展[J]. 林浩然. 中山大学学报(自然科学版). 2004(06)
[6]睾丸创伤后LH、FSH、T变化研究[J]. 史恩祥,沈喜,智强,朱立璋,史功,闫玉华. 中国优生与遗传杂志. 2003(04)
[7]卵泡刺激素研究进展[J]. 关洪斌,李庆章. 东北农业大学学报. 2002(03)
[8]卵泡刺激素基因研究概况[J]. 李凤娥,熊远著. 国外畜牧学(猪与禽). 2001(01)
[9]神经内分泌因子调控鱼类生殖和生长的相互作用[J]. 林浩然. 动物学研究. 2000(01)
[10]人绒毛膜促性腺激素α、β亚基cDNA的筛选与序列分析[J]. 苟德明,李文鑫,黄健,夏总平,李治,蒋达和. 中国生物化学与分子生物学报. 1999(06)
本文编号：3728827
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【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文献综述
1.1 下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）的简介
1.2 LH和FSH的生理结构及功能
1.3 LH和FSH的生物合成及作用机理
1.4 LH和FSH在硬骨鱼类中的研究进展
1.5 硬骨鱼类中AMH，StAR，17β-HSD及E2，11-kT的研究
1.6 研究内容
1.7 技术路线
第二章 金钱鱼促性腺激素基因全长的cDNA克隆
2.1 实验材料
2.1.1 实验用鱼
2.1.2 试剂
2.1.2.1 主要试剂
2.1.2.2 相关试剂的配制
2.1.3 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 组织取材
2.2.2 总RNA提取
2.2.3 模板cDNA的制备
2.2.4 引物设计
2.2.5 金钱鱼GtH全长的RACE克隆
2.2.5.1 模板cDNA的 3’RACE
2.2.5.2 模板cDNA的 5’RACE
2.2.5.3 金钱鱼GtH中间片段的克隆扩增
2.2.5.4 目的基因的连接，转化
2.2.5.5 阳性克隆菌的筛选
2.2.6 金钱鱼GtH的全长序列分析
2.3 结果
第三章 金钱鱼促性腺激素重组蛋白的原核表达及纯化
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 重组质粒r-SaGtH的构建
3.2.1.1 目的基因GtH的扩增
3.2.1.2 克隆载体pEasy-T1-GtH的构建
3.2.1.3 载体质粒pEasy-T1-GtH的提取
3.2.2 重组蛋白r-SaGtH的诱导表达及纯化
3.2.2.1 重组蛋白r-SaGtH的粗提
3.2.2.2 重组融合蛋白r-SaGtH的纯化
3.2.2.3 重组蛋白r-SaGtH的Western Blot检测
3.3 结果
第四章 金钱鱼促性腺激素重组蛋白功能的初步验证
4.1 实验材料
4.1.1 实验用鱼
4.1.2 主要试剂、仪器
4.2 实验方法
4.2.1 重组蛋白r-SaGtH的注射和投喂实验
4.2.1.1 重组蛋白r-SaGtH的注射实验
4.2.1.2 重组蛋白r-SaGtH的投喂实验
4.2.2 青鱂性腺的组织学切片观察
4.2.2.1 青鱂性腺的石蜡切片
4.2.2.2 青鱂性腺的H&E染色
4.2.3 金钱鱼性腺的扫描电子显微镜观察
4.2.3.1 扫描电子显微镜观察中主要试剂的配制
4.2.3.1.1 固定液Karnovsky溶液的配制方法
4.2.3.1.2 磷酸盐缓冲液PB溶液的配制方法
4.2.3.2 扫描电子显微镜观察上机样品的制备
4.2.4 金钱鱼性腺成熟部分相关基因的表达分析
4.2.5 金钱鱼性腺成熟部分相关激素的测定
4.3 结果
4.3.1 青鱂性腺的组织学切片观察
4.3.2 金钱鱼性腺的扫描电子显微镜观察
4.3.3 金钱鱼性腺成熟相关基因的表达分析
4.3.3.1 金钱鱼促性腺激素受体（SaGtHR）的表达分析
4.3.3.2 金钱鱼生殖轴部分下游基因（Amh，Star，17β-hsd）的表达分析
4.3.4 金钱鱼性腺成熟部分相关激素的测定
第五章 小结和讨论
参考文献
附录
硕士期间科研成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性[J]. 柳学周,徐永江,廖梅杰,潘传燕,王妍妍. 中国水产科学. 2013(01)
[2]金钱鱼繁殖生物学及诱导产卵试验[J]. 蔡泽平,王毅,胡家玮,张俊彬,林岳光. 热带海洋学报. 2010(05)
[3]Fish germ cells[J]. XU HongYan1, LI MingYou1, GUI JianFang2 ＆ HONG YunHan1,2 1Department of Biological Sciences, National University of Singapore, Singapore 119260, Singapore; 2 State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China. Science China（Life Sciences）. 2010(04)
[4]金钱鱼生物学研究及回顾[J]. 兰国宝,阎冰,廖思明,罗砚,谢若痴. 水产科学. 2005(07)
[5]促性腺激素释放激素（GnRH）结构与功能及其受体的进化发展[J]. 林浩然. 中山大学学报(自然科学版). 2004(06)
[6]睾丸创伤后LH、FSH、T变化研究[J]. 史恩祥,沈喜,智强,朱立璋,史功,闫玉华. 中国优生与遗传杂志. 2003(04)
[7]卵泡刺激素研究进展[J]. 关洪斌,李庆章. 东北农业大学学报. 2002(03)
[8]卵泡刺激素基因研究概况[J]. 李凤娥,熊远著. 国外畜牧学(猪与禽). 2001(01)
[9]神经内分泌因子调控鱼类生殖和生长的相互作用[J]. 林浩然. 动物学研究. 2000(01)
[10]人绒毛膜促性腺激素α、β亚基cDNA的筛选与序列分析[J]. 苟德明,李文鑫,黄健,夏总平,李治,蒋达和. 中国生物化学与分子生物学报. 1999(06)
本文编号：3728827
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