鱼类淋巴囊肿病毒32kDa黏附蛋白的特性分析
发布时间：2023-03-04 15:05
淋巴囊肿病毒（lymphocystis disease virus, LCDV）是鱼类淋巴囊肿病的病原，呈世界性分布，可感染42科140种以上的淡水、半咸水和海水鱼类。该病自1997年在我国山东威海地区的养殖牙鲆中首次暴发以来，迅速蔓延至辽宁、河北、浙江等沿海省份，给我国的鱼类养殖业造成巨大经济损失。LCDV是具有囊膜的大分子DNA病毒，囊膜病毒通过囊膜上的单个或多个黏附蛋白与宿主靶细胞上的受体蛋白发生特异性结合而吸附到靶细胞表面，介导病毒与细胞上的蛋白发生构型变化，促进宿主细胞膜与病毒囊膜融合，使病毒的遗传物质进入细胞内部进行复制。研究病毒囊膜上的黏附蛋白对于阐明病毒感染和致病的分子机制具有重要意义。 实验室前期曾在牙鲆（Paralichthys olivaceus）鳃细胞（FG）上鉴定出一个分子量为27.8kDa的LCDV细胞受体蛋白，并制备了2株抗27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体（2G11、3D9），2株抗体都能有效阻断LCDV对FG细胞的感染。应用抗27.8kDa受体蛋白单克隆抗体与Far-western技术在LCDV上发现一个分子量为32kDa的蛋白能够与27.8kDa受体...
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 鱼类淋巴囊肿病的研究进展
1.1.1 淋巴囊肿病毒流行病学研究
1.1.2 淋巴囊肿病毒病理学研究
1.1.3 淋巴囊肿病毒结构研究
1.1.4 淋巴囊肿病的生物分子学研究
1.1.5 淋巴囊肿病毒病的预防与治疗
1.2 囊膜病毒侵染机制的研究进展
1.2.1 病毒囊膜蛋白的结构与功能
1.2.2 囊膜病毒的侵染机制
1.3 蛋白表达系统及纯化技术简述
1.3.1 蛋白质纯化技术
1.3.2 蛋白的表达系统
2 淋巴囊肿病毒 32kDa 囊膜蛋白的原核表达及其多抗制备
2.1 材料与方法
2.1.1 淋巴囊肿病毒的提纯
2.1.2 淋巴囊肿病毒 DNA 的提取及 ORF038 基因表达引物的设计
2.1.3 ORF038 基因片段的扩增、纯化及双酶切
2.1.4 ORF038 基因与 pET32a 双酶切
2.1.5 连接、转化与阳性菌株检测
2.1.6 表达载体的菌落 PCR 及双酶切检测
2.1.7 表达载体 pET32a-ORF038 在大肠杆菌中的诱导表达
2.1.8 SDS-PAGE 检测重组菌表达情况
2.1.9 ORF038 重组表达蛋白的纯化
2.1.10 多克隆抗体的制备
2.1.11 ELISA 检测 ORF038 重组蛋白与多抗的结合
2.1.12 Western-blot 检测多抗与重组表达蛋白及 LCDV 蛋白结合
2.1.13 淋巴囊肿病毒 32kDa 蛋白的免疫电镜定位
2.2 结果
2.2.1 淋巴囊肿病毒粒子的纯化
2.2.2 LCDV-ORF038 目的片段的扩增
2.2.3 pET32a-ORF038 重组表达质粒的双酶切检测
2.2.4 重组菌的诱导表达及表达产物的纯化
2.2.5 多抗与 LCDV ORF038 重组表达蛋白的结合
2.2.6 多抗与重组表达蛋白及 LCDV 蛋白的结合
2.2.7 ORF038 蛋白的免疫电镜结果
2.3 讨论
3 LCDV ORF038 重组蛋白与受体蛋白的相互作用
3.1 材料与方法
3.1.1 牙鲆鳃细胞膜蛋白的提取
3.1.2 阻断 ELISA 实验
3.1.3 FITC 荧光素标记的 ORF038 重组表达蛋白的制备
3.1.4 免疫荧光技术检测 ORF038 重组表达蛋白与 FG 细胞的结合
3.2 结果
3.2.1 ORF038 重组表达蛋白阻断实验
3.2.2 LCDV ORF038 重组表达蛋白与 FG 细胞结合的免疫荧光结果
3.3 讨论
4 淋巴囊肿病毒 32kDa 黏附蛋白在感染 FG 细胞中的作用
4.1 材料与方法
4.1.1 FG 细胞的体外培养
4.1.2 病毒体外感染中和实验
4.2 结果
4.2.1 FG 细胞的培养状况
4.2.2 抗 ORF038 重组蛋白多抗抑制 LCDV 侵染 FG 细胞
4.3 讨论
总结
参考文献
致谢
个人简历
硕士期间发表文章
本文编号：3754501
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 鱼类淋巴囊肿病的研究进展
1.1.1 淋巴囊肿病毒流行病学研究
1.1.2 淋巴囊肿病毒病理学研究
1.1.3 淋巴囊肿病毒结构研究
1.1.4 淋巴囊肿病的生物分子学研究
1.1.5 淋巴囊肿病毒病的预防与治疗
1.2 囊膜病毒侵染机制的研究进展
1.2.1 病毒囊膜蛋白的结构与功能
1.2.2 囊膜病毒的侵染机制
1.3 蛋白表达系统及纯化技术简述
1.3.1 蛋白质纯化技术
1.3.2 蛋白的表达系统
2 淋巴囊肿病毒 32kDa 囊膜蛋白的原核表达及其多抗制备
2.1 材料与方法
2.1.1 淋巴囊肿病毒的提纯
2.1.2 淋巴囊肿病毒 DNA 的提取及 ORF038 基因表达引物的设计
2.1.3 ORF038 基因片段的扩增、纯化及双酶切
2.1.4 ORF038 基因与 pET32a 双酶切
2.1.5 连接、转化与阳性菌株检测
2.1.6 表达载体的菌落 PCR 及双酶切检测
2.1.7 表达载体 pET32a-ORF038 在大肠杆菌中的诱导表达
2.1.8 SDS-PAGE 检测重组菌表达情况
2.1.9 ORF038 重组表达蛋白的纯化
2.1.10 多克隆抗体的制备
2.1.11 ELISA 检测 ORF038 重组蛋白与多抗的结合
2.1.12 Western-blot 检测多抗与重组表达蛋白及 LCDV 蛋白结合
2.1.13 淋巴囊肿病毒 32kDa 蛋白的免疫电镜定位
2.2 结果
2.2.1 淋巴囊肿病毒粒子的纯化
2.2.2 LCDV-ORF038 目的片段的扩增
2.2.3 pET32a-ORF038 重组表达质粒的双酶切检测
2.2.4 重组菌的诱导表达及表达产物的纯化
2.2.5 多抗与 LCDV ORF038 重组表达蛋白的结合
2.2.6 多抗与重组表达蛋白及 LCDV 蛋白的结合
2.2.7 ORF038 蛋白的免疫电镜结果
2.3 讨论
3 LCDV ORF038 重组蛋白与受体蛋白的相互作用
3.1 材料与方法
3.1.1 牙鲆鳃细胞膜蛋白的提取
3.1.2 阻断 ELISA 实验
3.1.3 FITC 荧光素标记的 ORF038 重组表达蛋白的制备
3.1.4 免疫荧光技术检测 ORF038 重组表达蛋白与 FG 细胞的结合
3.2 结果
3.2.1 ORF038 重组表达蛋白阻断实验
3.2.2 LCDV ORF038 重组表达蛋白与 FG 细胞结合的免疫荧光结果
3.3 讨论
4 淋巴囊肿病毒 32kDa 黏附蛋白在感染 FG 细胞中的作用
4.1 材料与方法
4.1.1 FG 细胞的体外培养
4.1.2 病毒体外感染中和实验
4.2 结果
4.2.1 FG 细胞的培养状况
4.2.2 抗 ORF038 重组蛋白多抗抑制 LCDV 侵染 FG 细胞
4.3 讨论
总结
参考文献
致谢
个人简历
硕士期间发表文章
本文编号：3754501
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3754501.html
