短蛸无脊椎动物型溶菌酶的分子克隆和功能分析
发布时间：2023-04-02 14:46
短蛸(Octopus ocellatus)是我国沿海地区重要的经济品种,针对日益严峻的水产养殖形势和海洋生态问题,迫切需要从分子水平了解短蛸免疫机制,探讨提高其抗病力的途径,改进种质资源的品质,为海洋生态和水产养殖的可持续发展提供理论支持。短蛸缺乏获得性免疫,在抵御微生物侵袭时主要依赖固有免疫系统。溶菌酶作为重要的免疫效应因子,在机体免疫防御反应中可以直接抵抗病原微生物,也可以诱导机体合成和分泌其他免疫因子。溶菌酶通过水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键裂解不溶性的肽聚糖,使细菌细胞壁破裂起到杀菌作用。依据来源和结构的不同将溶菌酶分为六大类型:c型、g型、植物型、细菌型、噬菌体型和i型,其中i型溶菌酶作为无脊椎动物所特有的一种溶菌酶主要分布在环节动物门、棘皮动物门、软体动物门和节肢动物门中。本研究以课题组已构建的短蛸c DNA文库为基础,运用现代分子生物学技术克隆获得短蛸i型溶菌酶(Oo Lys)基因;对该基因序列进行了生物信息学分析;检测了Oo Lys在短蛸各组织及其受到鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后在血细胞中的表达规律;利用DNA重组技术构建了以大肠杆菌BL21(...
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文献综述
1.1 海洋贝类先天性免疫
1.2 海洋贝类的免疫防御机制
1.2.1 细胞免疫
1.2.2 体液免疫
1.2.2.1 凝集素
1.2.2.2 抗菌肽
1.2.2.3 溶酶体酶
1.2.2.4 化学递质
1.3 免疫防御过程
1.3.1 免疫识别
1.3.1.1 病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns， PAMPs)
1.3.1.2 模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)
1.3.2 免疫信号的传导
1.3.2.1 Toll/dif途径
1.3.2.2 Imd/Relish途径
1.3.3 病原体的清除(Pathogen elimination)
1.4 溶菌酶的分类和功能
1.4.1 溶菌酶的分类
1.4.1.1 c型溶菌酶
1.4.1.2 g型溶菌酶
1.4.1.3 i型溶菌酶
1.4.2 溶菌酶的功能
1.4.2.1 溶菌酶的免疫功能
1.4.2.2 溶菌酶的消化功能
1.5 本研究的目的和意义
1.5.1 研究目的
1.5.2 研究的意义
第二章 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的克隆及表达分析
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物和菌株
2.1.2 实验仪器
2.1.3 实验试剂和引物
2.2 实验方法
2.2.1 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的c DNA全长克隆
2.2.2 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的序列分析
2.2.3 短蛸总RNA的提取和c DNA的合成
2.2.3.1 组织的采集
2.2.3.2 总RNA的提取
2.2.3.3 c DNA的合成
2.2.4 Oo Lys定量引物的设计
2.2.5 短蛸不同组织Oo Lys的m RNA的表达分析
2.2.6 鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后Oo Lys的m RNA在血细胞中的表达规律
2.3 实验结果
2.3.1 Oo Lys的c DNA全长及氨基酸序列特征
2.3.2 Oo Lys的同源分析和进化树的构建
2.3.3 Oo Lys的三级结构
2.3.4 Oo Lys的m RNA在各组织中的表达规律
2.3.5 细菌刺激后Oo Lys的m RNA在血细胞中的表达规律
2.4 讨论
第三章 重组质粒的构建及蛋白的纯化复性
3.1 实验材料
3.1.1 实验样品
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂和引物
3.1.4 实验试剂的配制
3.2 实验方法
3.2.1 Oo Lys目的片段的获取
3.2.2 切胶回收
3.2.3 重组质粒的构建
3.2.4 质粒抽提
3.2.5 Oo Lys基因的表达转化
3.2.6 重组蛋白的表达与检测
3.2.7 重组蛋白的纯化
3.2.8 重组蛋白的复性和浓度测定
3.2.8.1 重组蛋白的复性
3.2.8.2 重组蛋白的浓缩和浓度测定
3.2.9 多克隆抗体的制备
3.2.10 多克隆抗体特异性的检测
3.3 实验结果
3.3.1 原核表达系统
3.3.2 纯化与复性的r Oo Lys
3.4 讨论
第四章 rOo Lys的活性分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验样品
4.1.2 实验仪器
4.1.3 实验试剂
4.2 实验方法
4.2.1 r Oo Lys的溶菌活性分析
4.2.2 热处理r Oo Lys后的溶菌活性分析
4.2.3 r Oo Lys的胞壁酸酶活性分析
4.2.4 r Oo Lys对鳗弧菌的抑菌作用分析
4.3 实验结果
4.3.1 r Oo Lys的溶菌活性
4.3.2 热处理后r Oo Lys的活性
4.3.3 r Oo Lys的胞壁酸酶活性
4.3.4 r Oo Lys对鳗弧菌的抑菌作用
4.4 讨论
结论
参考文献
已完成文章
项目支持
致谢
本文编号：3779409
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【学位级别】：硕士
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摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文献综述
1.1 海洋贝类先天性免疫
1.2 海洋贝类的免疫防御机制
1.2.1 细胞免疫
1.2.2 体液免疫
1.2.2.1 凝集素
1.2.2.2 抗菌肽
1.2.2.3 溶酶体酶
1.2.2.4 化学递质
1.3 免疫防御过程
1.3.1 免疫识别
1.3.1.1 病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns， PAMPs)
1.3.1.2 模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)
1.3.2 免疫信号的传导
1.3.2.1 Toll/dif途径
1.3.2.2 Imd/Relish途径
1.3.3 病原体的清除(Pathogen elimination)
1.4 溶菌酶的分类和功能
1.4.1 溶菌酶的分类
1.4.1.1 c型溶菌酶
1.4.1.2 g型溶菌酶
1.4.1.3 i型溶菌酶
1.4.2 溶菌酶的功能
1.4.2.1 溶菌酶的免疫功能
1.4.2.2 溶菌酶的消化功能
1.5 本研究的目的和意义
1.5.1 研究目的
1.5.2 研究的意义
第二章 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的克隆及表达分析
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物和菌株
2.1.2 实验仪器
2.1.3 实验试剂和引物
2.2 实验方法
2.2.1 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的c DNA全长克隆
2.2.2 短蛸溶菌酶(Oo Lys)基因的序列分析
2.2.3 短蛸总RNA的提取和c DNA的合成
2.2.3.1 组织的采集
2.2.3.2 总RNA的提取
2.2.3.3 c DNA的合成
2.2.4 Oo Lys定量引物的设计
2.2.5 短蛸不同组织Oo Lys的m RNA的表达分析
2.2.6 鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后Oo Lys的m RNA在血细胞中的表达规律
2.3 实验结果
2.3.1 Oo Lys的c DNA全长及氨基酸序列特征
2.3.2 Oo Lys的同源分析和进化树的构建
2.3.3 Oo Lys的三级结构
2.3.4 Oo Lys的m RNA在各组织中的表达规律
2.3.5 细菌刺激后Oo Lys的m RNA在血细胞中的表达规律
2.4 讨论
第三章 重组质粒的构建及蛋白的纯化复性
3.1 实验材料
3.1.1 实验样品
3.1.2 实验仪器
3.1.3 实验试剂和引物
3.1.4 实验试剂的配制
3.2 实验方法
3.2.1 Oo Lys目的片段的获取
3.2.2 切胶回收
3.2.3 重组质粒的构建
3.2.4 质粒抽提
3.2.5 Oo Lys基因的表达转化
3.2.6 重组蛋白的表达与检测
3.2.7 重组蛋白的纯化
3.2.8 重组蛋白的复性和浓度测定
3.2.8.1 重组蛋白的复性
3.2.8.2 重组蛋白的浓缩和浓度测定
3.2.9 多克隆抗体的制备
3.2.10 多克隆抗体特异性的检测
3.3 实验结果
3.3.1 原核表达系统
3.3.2 纯化与复性的r Oo Lys
3.4 讨论
第四章 rOo Lys的活性分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验样品
4.1.2 实验仪器
4.1.3 实验试剂
4.2 实验方法
4.2.1 r Oo Lys的溶菌活性分析
4.2.2 热处理r Oo Lys后的溶菌活性分析
4.2.3 r Oo Lys的胞壁酸酶活性分析
4.2.4 r Oo Lys对鳗弧菌的抑菌作用分析
4.3 实验结果
4.3.1 r Oo Lys的溶菌活性
4.3.2 热处理后r Oo Lys的活性
4.3.3 r Oo Lys的胞壁酸酶活性
4.3.4 r Oo Lys对鳗弧菌的抑菌作用
4.4 讨论
结论
参考文献
已完成文章
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致谢
本文编号：3779409
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