海洋细菌PD-2抑藻活性研究及群体感应基因zlb I敲除方法的建立

发布时间：2023-09-03 19:50

　　海洋环境中的溶藻细菌是一类对海洋微藻生长具有抑制作用，能裂解或直接杀死藻细胞的细菌。研究溶藻细菌的功能与机制是藻菌作用关系的热点问题，对探讨赤潮的生物治理等关键科学问题具有重要的指导意义。本文以一株微藻共栖细菌Rhodobacteraceae strain PD-2为研究对象，探明了它释放的抑藻物质和作用方式，确定了其群体感应基因，并建立了利用同源重组技术敲除群体感应基因的方法。主要研究内容包括： 对微藻共栖细菌Rhodobacteraceae strain PD-2的培养条件进行了优化实验，通过对比不同条件下的细菌密度、抑藻活性，获得最适的培养温度和培养基添加成分。结果表明采用Zobell2216E加葡萄糖培养基，30C的条件下培养细菌密度和抑藻活性最高。利用基于生物传感器的双层琼脂法对PD-2产生的AHLs信号分子的种类进行了初步研究，发现该菌至少可以产生3种AHLs分子，并与标准品比较，其中可能存在新种类的AHLs。 应用之前实验获得的最适培养条件对具有抑藻效果的微藻共栖细菌PD-2进行大规模的发酵培养，利用各种化学分离纯化手段与生物活性示踪方法(生物自显影)对其代谢产物中的抑藻...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1 赤潮的成因及发生过程
        1.1 赤潮形成的原因
        1.2 赤潮的发生过程
        1.3 赤潮生消与微生物的关系
    2 赤潮的生物防治
        2.1 海洋抑藻微生物的多样性
            2.1.1 利用病毒抑制微藻的生长
            2.1.2 利用真菌抑制微藻的生长
            2.1.3 利用细菌抑制微藻的生长
            2.1.4 利用放线菌抑制微藻的生长
        2.2 海洋微生物抑藻方式及其作用机理
            2.2.1 直接溶藻
            2.2.2 间接溶藻
        2.3 海洋溶藻菌抑藻物质的种类
            2.3.1 蛋白质
            2.3.2 抗生素
            2.3.3 多肽
            2.3.4 氨基酸
            2.3.5 含氮类化合物
            2.3.6 其它抑藻物质
    3 海洋细菌的抑藻与群体感应现象
    4 本文研究的目的和意义
第二章 海洋抑藻细菌 PD-2 培养条件的优化及 AHLs 产生特性研究
    1 前言
    2 实验部分
        2.1 实验材料及仪器试剂
            2.1.1 实验材料与培养条件
            2.1.2 实验药品及试剂
            2.1.3 实验仪器
            2.1.4 培养基及溶液配制
        2.2 实验方法
            2.2.1 细菌 PD-2 培养条件优化
            2.2.2 细菌 PD-2 代谢产物的提取
            2.2.3 不同培养条件下抑藻活性检测
            2.2.4 不同培养条件下 AHLs 含量大小定性检测
            2.2.5 AHLs 信号分子产生量与细菌密度生长关系
            2.2.6 利用 TLC 生物自显影方法研究细菌 PD-2 中 AHLs 的种类
    3 实验结果
        3.1 不同培养条件抑藻细菌 PD-2 的生长特性
        3.2 不同生长条件对抑藻活性的影响
        3.3 不同生长条件下对 AHLs 产生的影响
        3.4 AHLs 信号分子产生量与细菌密度生长关系
        3.5 基于 TLC 生物自显影方法研究细菌 PD-2 中 AHLs 的种类
    4 本章小结
第三章 海洋微藻共栖细菌抑藻化合物的分离纯化及结构解析
    1 前言
    2 实验部分
        2.1 实验材料及仪器试剂
            2.1.1 实验材料与培养条件
            2.1.2 实验药品及试剂
            2.1.3 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 菌株培养和发酵
            2.2.2 细菌代谢产物的提取
            2.2.3 细菌抑藻活性代谢产物的分离纯化及活性检测
            2.2.4 抑藻化合物分子量的测定
            2.2.5 NMR 测定
            2.2.6 抑藻化合物的抑藻作用方式
    3 实验结果
        3.1 细菌 PD-2 代谢产物中抑藻化合物的分离纯化
            3.1.1 TLC 分离纯化抗菌化合物
            3.1.2 抑藻活性的初步检测
            3.1.3 3 号样品分离纯化抑藻化合物
        3.2 细菌 PD-2 代谢产物中抑藻化合物分子量的测定
        3.3 NMR 解析抑藻化合物的结构
        3.4 抑藻化合物的抑藻作用方式
    4 本章小结
第四章 抑藻细菌 PD-2 中 luxI/R 同源基因敲除方法的建立
    1 抑藻细菌 PD-2 中 luxI/R 同源基因序列的探明
        1.1 前言
        1.2 实验部分
            1.2.1 实验材料及试剂
            1.2.2 实验方法
        1.3 实验结果与讨论
            1.3.1 细菌 PD-2 中 luxI/R 同源基因序列的分析
            1.3.2 luxI/R 同源基因克隆
        1.4 小结
    2 PD-2 与 E.coli S17-1 pSRK Gm 结合能力研究
        2.1 前言
        2.2 实验部分
            2.2.1 实验材料及实验仪器
            2.2.2 实验方法
        2.3 实验结果
            2.3.1 细菌 PD-2 利福平突变株的筛选
            2.3.2 细菌 PD-2-Rif-R-001 与 E.coli S17-1 pSRK Gm 结合实验
            2.3.3 结合菌株中 pSRK Gm 质粒的确认
            2.3.4 细菌 PD-2 与 E.coli S17-1 pSRK Gm 结合培养条件优化
        2.4 小结
    3 zlb I 上下游基因片段的融合及自杀质粒重组子的构建
        3.1 前言
        3.2 实验部分
            3.2.1 实验材料及实验仪器
            3.2.2 实验方法
        3.3 实验结果
            3.3.1 zlb I 上下游基因的克隆与连接
            3.3.2 E.coli S17-1 pNPTS 138 Kan 重组转化子的构建
        3.4 小结
第五章 结论
参考文献
在读期间发表论文
致谢
附录



本文编号：3845674