罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用

发布时间：2024-12-27 00:53

　　行有性生殖的生物都有两种不同的性别,发育过程中都涉及到性别决定。因此,性别决定与分化及其分子机制是最基础的生物学问题之一。哺乳类性别决定与分化是由一系列转录因子和信号传导因子连接成网构成的协同作用通路,而硬骨鱼类还不清楚。许多经济动物(养殖鱼类)生长速率有明显的性别差异,如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)雄鱼比雌鱼生长快50%,单性鱼养殖具有较高的经济价值,因此养殖鱼类性别决定与分化的分子机制及性别控制成为水产动物学研究的热点,可以兼顾基础和应用研究。随着大片段基因组文库的构建和高通量DNA测序技术的发展,罗非鱼基因组序列已经公布,但缺乏Y染色体信息,有必要构建含Y染色体信息的大片段基因组文库。长期以来,养殖鱼类缺乏有效的基因敲除手段严重阻碍了其性别决定和分化分子机制的研究。近几年,人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术TALEN和CRISPR/Cas9的出现使我们能对任意物种的基因组进行定点编辑。因此,本研究将探索在罗非鱼建立这两种基因敲除技术,并用于对dmrt1、foxl2、igf3和nanos等基因敲除,研究它们在性别决定与分化中的作用及分子机制。主要研究结果如...

【文章页数】：134 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 大片段基因组文库的研究进展
        1.1 噬菌体文库
        1.2 Cosmid文库
        1.3 Fosmid文库
        1.4 BAC文库
        1.5 YAC文库
        1.6 大片段基因组文库的应用
    2 反向遗传学技术研究概述
        2.1 同源重组
        2.2 RNAi
        2.3 Morpholinos
        2.4 TILLING
        2.5 ZFN
        2.6 TALEN
        2.7 CRISPR/Cas9
        2.8 反向遗传学技术在性别决定与分化研究中的应用
    3 脊椎动物性别决定与分化研究进展
    4 科学问题的提出和本研究目的意义
第二章 罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库的构建及基因筛选
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
        2.2 主要试剂
        2.3 方法
            2.3.1 尼罗罗非鱼XY个体基因组DNA的提取
            2.3.2 基因组DNA片段的末端修复
            2.3.3 连接、包装和滴度计算
            2.3.4 插入片段大小检测
            2.3.5 文库的稳定性检测
            2.3.6 克隆的挑取、池的构建及备份保存
            2.3.7 基因筛选方法
    3 结果
        3.1 抽提的DNA片段大小
        3.2 DNA片段回收与载体的连接
        3.3 文库滴度
        3.4 插入片段大小
        3.5 文库稳定性
        3.6 文库克隆的保存和池的构建及备份
        3.7 文库的应用—目的基因筛选结果
    4 讨论
        4.1 Fosmid文库质量鉴定、保存及基因筛选策略
        4.2 Fosmid文库在性别决定和分化研究中的应用
第三章 利用TALEN基因敲除技术研究Foxl2和Dmrt1功能
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 实验动物
        2.2 主要试剂和TALEN载体
        2.3 方法
            2.3.1 TALEN打靶序列的选择和载体构建策略
            2.3.2 mRNA合成与显微注射
            2.3.3 基因组DNA的提取、目的片段的扩增及酶切检测
            2.3.4 阳性鱼筛选
            2.3.5 组织学检测
            2.3.6 免疫组化检测
            2.3.7 Real-time PCR检测
            2.3.8 RT-PCR检测
            2.3.9 血清雌雄激素水平测定
    3 结果
        3.1 TALEN成功敲除dmrt1和foxl2基因
        3.2 Dmrt1缺失对XY个体罗非鱼性腺分化的影响
        3.3 Foxl2缺失对XX个体罗非鱼性腺分化的影响
        3.4 Dmrt1和Foxl2缺失对雌激素和雄激素合成的影响
    4 讨论
        4.1 养殖鱼类罗非鱼TALEN靶向基因敲除技术的建立
        4.2 Dmrt1缺失对精巢分化的影响
        4.3 Foxl2缺失对卵巢发育的影响
        4.4 Dmrt1和Foxl2拮抗性调控雌激素水平影响性别分化
第四章 利用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究Nanos2和Nanos3的功能
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 实验动物
        2.2 主要试剂和载体
        2.3 方法
            2.3.1 靶序列的选择和gRNA合成
            2.3.2 Cas9 mRNA合成与显微注射
            2.3.3 基因组DNA的提取、目的片段扩增及突变检测
            2.3.4 GFP-vasa 3'UTR载体构建和生殖细胞GFP标记
            2.3.5 敲除阳性鱼的筛选
            2.3.6 组织学检测
            2.3.7 免疫组化检测
            2.3.8 激素测定
            2.3.9 dmrt1和foxl2突变F1代的建立
    3 结果
        3.1 CRISPR/Cas9成功敲除罗非鱼基因
        3.2 敲除效率统计
        3.3 Nanos缺失对生殖细胞和性别分化的影响
        3.4 生殖细胞缺失对雌激素和雄激素合成的影响
        3.5 dmrt1和foxl2突变F1代鱼检测
    4 讨论
        4.1 CRISPR/Cas9高效敲除罗非鱼性别决定与分化关键基因
        4.2 CRISPR/Cas9介导突变的可遗传性
        4.3 生殖细胞缺失对性别分化的影响
        4.4 CRISPR/Cas9在性别决定与分化研究的应用前景
    附件
第五章 利用CRISPR/Cas9研究Igf3在性别分化中的功能
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 实验动物
        2.2 试剂和药品
        2.3 igf3在性别分化早期表达模式检测
        2.4 免疫组化检测Igf3表达的细胞类型
        2.5 Igf3功能的离体研究
        2.6 CRISPR/Cas9敲除igf3对性别分化的影响
        2.7 荧光素酶报告基因和表达载体的构建
        2.8 HEK283细胞培养、瞬时转染以及荧光素酶检测
        2.9 Dmrt1和Foxl2缺失对igf3表达水平的影响
    3 结果
        3.1 igf3在罗非鱼性腺发育早期的表达模式
        3.2 Igf3表达于罗非鱼性腺体细胞
        3.3 Igf3调控性别分化相关类固醇酶和转录因子
        3.4 CRISPR/Cas9介导的够敲除
        3.5 igf3敲除对性别分化和相关基因表达的影响
        3.6 igf3表达受性别分化相关转录因子和雌激素的调控
    4 讨论
        4.1 igf3、转录因子和类固醇酶之间的关系
        4.2 Igf3与硬骨鱼类生殖细胞减数分裂
结论
本研究的主要创新点
参考文献
致谢
在读期间发表的主要论文
在读期间参加科研情况



本文编号：4020888