设计人工“几丁质小体”降解几丁质

发布时间：2020-05-11 15:31

【摘要】：几丁质是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的多聚合物,是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源。N-乙酰-D-氨基葡萄糖是几丁质的完全降解产物,其在医药、食品、肥料、日化和能源等方面具有广泛的应用价值。目前,几丁质降解的传统方式是化学酸碱法进行降解,而在其降解过程中存在降解产物不纯和产生大量酸碱废液等缺点,使得几丁质资源未得到合理利用。而酶法降解几丁质是一种无污染、低成本、操作简单、产物易控制的高效降解方法。因此,生物酶法代替传统的化学法来生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖,是具有巨大的社会、经济价值以及学术价值的绿色可代替方法,是社会发展的必然。由于天然几丁质的不溶性严重阻碍了酶法降解几丁质的效率,因此,本研究模仿了纤维小体的结构,设计了人工几丁质小体,它能通过蛋白支架Scaf将几丁质内切酶(SaChiB)、几丁质外切酶(SaHex)以及裂解多糖单加氧酶(LPMO)连接起来,协同降解几丁质小体以实现目的酶和底物的空间定位,进而通过不同种类的酶来实现高效降解几丁质的目的。1、本研究根据纤维小体的模式设计了人工“几丁质小体”。通过Linker将几丁质结合结构域(CBD)与3种不同的Cohesin连接构成几丁质小体中重要的蛋白支架Scaf,Scaf不具有降解几丁质的活性。2、PCR扩增三种具有协同作用的几丁质酶基因以及不同来源的Dockerin基因,通过无缝克隆的方法成功得到了重组质粒pET30a(+)-LPMO-Dockerin、pET30a(+)-Dockerin-SaHex、pET30a(+)-SaChiB-Dockerin。3、将带有重组酶基因的三种质粒以及合成的支架蛋白Scaf转入大肠杆菌BL21(DE3)中,并得到了高效表达,重组蛋白及支架蛋白通过Ni-NTA纯化后,等摩尔比进行自组装,经Native-PAGE凝胶检测试验表明,蛋白组装成功。4、对组装后的几丁质小体进行酶学性质试验,结果表明其最适pH为8.0,最适温度为30℃。通过最适酶量试验表明,其最适加酶量为40μM。通过几丁质小体与游离酶降解几丁质效果比较试验表明,在最佳反应条件下,与游离酶组合体系相比,几丁质小体的降解效率提高了2.53倍。
【图文】：

示意图,几丁质,小体,示意图

由微生物进行分泌的几丁质酶种类多样，种类不同的几丁质酶，它们的结构与性质有很大的差异，根据酶与底物发生反应的不同位置、降解后产生的产物可以将几丁质酶划分为以下三类：（1）几丁质内切酶（endochitinase EC3.2.1.14）沿着几丁质链随机进行切割糖苷键，生成二聚体（二乙酰基壳二糖）和由 GlcNAc 组成的可溶性低分子量多聚体，例如壳三糖和壳寡糖[16]。（2）几丁质外切酶（exochitinase）将几丁质内切酶与几丁质反应后的产物进一步进行水解反应[16]。可分为两个亚类：一类是几丁二糖酶（chitobiosidase，EC3.2.1.29），可从多糖的非还原端裂解几丁质或者几丁质寡聚物，，释放的最终产物主要是二乙酰几丁二糖 [(GlcNAc)2] ；另一类为 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖苷酶（N-acetylglucosaminidases，EC3.2.1.30），和几丁二糖酶类似，都可从糖链的非还原端开始裂解几丁质或几丁质寡聚物，生成单体 N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，它也是唯一能水解(GlcNAc)2的酶[17-19]。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶大部分属于 20 家族[20]。但是还有部分糖苷水解酶属于 3 家族包括 Alteromonas sp. Cht60，E. coli Nag Z[22]，S.thermoviolaceus Nag A[23]，V. furnissii Exo II[24]等，均来源于微生物。

模型图,纤维小体,热纤梭菌,模型

图 3.热纤梭菌纤维小体模型Fig.3. The architecture of the cellulosome from C. thermocellum图 4. 热纤梭菌 CipA 基因簇Fig.4. Cip A gene cluster from C. thermocellum人工纤维小体的构建着纤维素小体研究的不断深入，纤维小体在转化纤维素晶体成可利用单了较为深入的成果。作为一种高效的纤维素降解机器，纤维素小体的人始取得成果，已经成为研究及改造自然界中纤维素小体的有力工具。研简单、具有必备元件（支架蛋白和重组酶模块）的微型纤维素小体(cellas; )[45]，这种纤维小体遵照了自然界中纤维小体的一般构成规则，不同
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ317

【参考文献】