代谢工程改造大肠杆菌生产α-氨基己二酸
发布时间：2022-01-06 12:34
α-氨基己二酸（α-Aminoadipic acid,AAA）是一种非蛋白质氨基酸。AAA是生物合成青霉素和头孢菌素等β-内酰胺抗生素的中间体,可用于化学合成抗风湿和抗癌的甲氨蝶呤衍生物。它还可用作生理活性肽（如肽抗生素和肽激素）的末端修饰剂等。目前AAA主要通过化学法合成,这些方法存在产量低和成本高的问题。本论文首次实现了大肠杆菌从头合成AAA,并通过系统代谢工程改造实现了产量的逐步提升。1、构建赖氨酸到AAA的下游途径:将酿酒酵母来源的赖氨酸酮戊二酸还原酶Lys1和酵母氨酸脱氢酶Lys9以及热红球菌来源的α-氨基己二酸半醛脱氢酶reAASADH引入大肠杆菌,通过添加前体赖氨酸实现了 α-氨基己二酸的生产。通过基因模块优化对三个酶的表达水平进行调节,将优化后的质粒表达组合转入BW25113在M10培养基发酵,从头合成α-氨基己二酸 249.93 mg·mL-1。2、增加前体赖氨酸的供应:通过敲除赖氨酸脱羧酶的编码基因（cadA和ldcC）,减少赖氨酸的降解;对赖氨酸合成过程中的限速酶天冬氨酸激酶和4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶DapA进行过表达,产量提高至453.73 mg·mL-1。...
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１代表性非蛋白质氨基酸的代谢网络Ｍ??Ｆｉｇ．?１－１?Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｎ?
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【参考文献】：
期刊论文
[1]异硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液相色谱法测定复序橐吾中21种氨基酸的含量[J]. 赵岩,彭蕾,陆珞,郜玉钢,蔡恩博,张连学. 中华中医药杂志. 2016(12)
[2]Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用[J]. 孙旭,周长林,方宏清. 生物技术通讯. 2011(06)
[3]微生物产赖氨酸的研究进展[J]. 刘晓飞,高学军,刘营,敖金霞,王青竹. 东北农业大学学报. 2010(01)
[4]Red同源重组技术研究进展[J]. 韩聪,张惟材,游松. 中国生物工程杂志. 2003(12)
[5]异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法同时测定18种氨基酸[J]. 杨菁,孙黎光,白秀珍,周海涛. 色谱. 2002(04)
博士论文
[1]基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸高产菌[D]. 徐建中.江南大学 2014
硕士论文
[1]中间产物转运调节及辅底物再生提高戊二酸产量[D]. 李文娜.北京化工大学 2018
[2]强化葡萄糖代谢途径提高L-赖氨酸发酵水平的研究[D]. 刘冬冬.江南大学 2017
[3]大肠杆菌生物合成苯酚及酶法合成高谷氨酸[D]. 杨森.北京化工大学 2017
[4]基于代谢工程构建大肠杆菌L-赖氨酸高产菌[D]. 赵德周.重庆大学 2017
[5]生产7-ACA废液中α-氨基己二酸的提取工艺研究[D]. 于桂花.河北科技大学 2010
本文编号：3572462
【文章来源】：北京化工大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１代表性非蛋白质氨基酸的代谢网络Ｍ??Ｆｉｇ．?１－１?Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｎ?
－＾?＾Ａｓｄ?ＤａｐＡ?＼?＼＿／??ｃｏｃＴ?ｃｏｃＴ?＇ｃｏｃＴ?－〇〇ｃ广?＂ｏｏｃ??？ＯＯＣ?ＯＯＣ?＿ｏｏｃ?ｏｏｃ?＋?ｈ３ｎ??ＣｏＡＳＨ?ＮＨ－Ｓｊｃｃ?ｙ—ＮＨ－Ｓｕｃｃ?）—ＫＨ３?Ｖ—ＮＨ３?＼??＾?ｆｒｒ?ｆ?－Ｓｒ??／?Ｃｉｌｕｌａｍａｔｃ?２－Ｏｊｃｏ＾ｌｉａａｉａｕ：?（?＼?＼?＼??＼＝〇?＿?／－ＮＨ３?ｙ—ＮＨ３?＿?ＮＨ３?＿?ＮＨ＾??－〇ｏｃ’?ＯＯＣ?－〇〇ｃ?ＯＯＣ?ＯＯＣ??图１＿２赖氨酸的二氨基庚二酸生物合成途径【３９］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｌｙｓｉｎｅ??赖氨酸的二氨基庚二酸生物合成途径在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中己经得到了??广泛研宄，被工程化用于工业化生产赖氨酸。与大肠杆菌中ＤＡＰ途径不同的是，谷??氨酸棒状杆菌中存在一个多功能酶一一内消旋－二氨基庚二酸脱氢酶（由基因＾洲编??码），可以发挥〇３？０、〇３？（：、〇３？￡和〇３？？四个酶的作用，将［－哌啶－２，６－二羧酸直??接还原为Ｄ，Ｌ－二氨基庚二酸酯??１．３．１．２?ａ－氨基己二酸途径??赖氨酸的ａ－氨基己二酸合成途径存在于类桉树和高等真菌中［３９］，其中ａ－氨基己??二酸是合成赖氨酸的前体。对该途径生化和遗传背景的了解主要源于对酿酒酵母的研??宂结果［３８，４１，４２］，—些发现也源于对解脂耶氏酵母［４３］、芥菜神经孢菌［４４］和念珠菌［４５］的研??究。??真菌中赖氨酸的生物合成需要八个步骤，涉及七个游离中间体。生成ａ－氨基己二??酸途径的前半部分步骤发生在线粒体中
ＫＧ?ＣＯ＾?ＮＡＤＨ??卜ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ?ＭＡｎＰ＋?６?Ｌ－ｕ－ａｍｉｎｏａｄｉｐｉｃ?ａｃｉｄ?５?？ｘ－ｋｅｔｏａｄｉｐｉｃ?ａｃｉｄ?＂?４?ｈｏｍｏｉｓｏｃｉｔｒｉｃ?ａｃｉｄ??ｉ?－Ｇｌｕ．?ＮＡＤＰＨ??乂??Ｘ?ｖｉｉ??）＼?．??ＮＡＤＰ＇Ｈ２０?ｈ?ｎＨ２?Ｈ?，Ｃ０２Ｈ?ＮＡＤ?，?Ｈ２０?Ｈ?ＮＨ２??ＶＶ，＇?ｒ?Ｈ０２Ｃ＾＾＾ＮＨ？??Ｂ?Ｌ－ｓａｃｃｈａｒｏｐｉｎｅ?＾Ｃ〇＾Ｈ?ＮＡＤＨ＾ＫＧ?９?Ｌ－，ｙｓ，ｎｅ??图１－３真菌中赖氨酸的（Ｉ－氨基己二酸合成途径［３７］??Ｆｉｇ．?１－３?ａ－ａｍｉｎｏａｄｉｐａｔｅ?ｐａｔｈｗａｙ?ｆｏｒ?ｌｙｓｉｎｅ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｉｎ?ｆｉｉｎｇｉ??１．３．２赖氨酸通过反向ｔ氨基己二酸途径降解??自然界中赖氨酸的降解方式差异很大［３７］。如图１－４所示，在真菌中，赖氨酸的ａ－??氨基己二酸合成途径的最后两个反应是由酵母氨酸脱氢酶和赖氨酸－ａ－酮戊二酸还原??酶催化的［３８，４６］，而在植物和动物中，则通过该途径的反向逆转步骤导致赖氨酸降解??４９］??〇???—？?Ｌｙｓｉｎｅ?ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｐｌａｎｔｓ?ａｎｄ?ａｎｉｍａｌｓ??ａ－Ｋｅｉｏｇｌｕｉａｒａｉｃ?Ｇｉｕｉａｍａｌｅ??Ｔ＾？－ＣＨｌＣＨ２－Ｃ－Ｃ〇（ｒ??ｂ?ｉ?ｔ?ｓｒ?Ｊ?Ｈ?３?ｈ??ＨｊＮ－ＯｌｊＣ＾ｊＣＨａＣＨｊ－ｔｌ－ｔｉＯＣｒ?Ｈ－ｔ－Ｎ?０１，０１，－?Ｃ－ａＸＴ＾?Ｊ－ＣＷＩＭ?卫ｚ＊?？?ＯＣ＾ａ＾ＭｊＯｉｒ?卜?ＸＸＴ??ＮＨｌ?３?＼?Ｗ?Ｚ?２ＮＢ＾?｜Ｔ?１?＼??Ｌｙｓｉ
【参考文献】：
期刊论文
[1]异硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液相色谱法测定复序橐吾中21种氨基酸的含量[J]. 赵岩,彭蕾,陆珞,郜玉钢,蔡恩博,张连学. 中华中医药杂志. 2016(12)
[2]Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用[J]. 孙旭,周长林,方宏清. 生物技术通讯. 2011(06)
[3]微生物产赖氨酸的研究进展[J]. 刘晓飞,高学军,刘营,敖金霞,王青竹. 东北农业大学学报. 2010(01)
[4]Red同源重组技术研究进展[J]. 韩聪,张惟材,游松. 中国生物工程杂志. 2003(12)
[5]异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法同时测定18种氨基酸[J]. 杨菁,孙黎光,白秀珍,周海涛. 色谱. 2002(04)
博士论文
[1]基于代谢工程选育谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸高产菌[D]. 徐建中.江南大学 2014
硕士论文
[1]中间产物转运调节及辅底物再生提高戊二酸产量[D]. 李文娜.北京化工大学 2018
[2]强化葡萄糖代谢途径提高L-赖氨酸发酵水平的研究[D]. 刘冬冬.江南大学 2017
[3]大肠杆菌生物合成苯酚及酶法合成高谷氨酸[D]. 杨森.北京化工大学 2017
[4]基于代谢工程构建大肠杆菌L-赖氨酸高产菌[D]. 赵德周.重庆大学 2017
[5]生产7-ACA废液中α-氨基己二酸的提取工艺研究[D]. 于桂花.河北科技大学 2010
本文编号：3572462
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