基于结构信息和生物计算的MAS1和PCL脂肪酶分子改造研究
发布时间：2022-01-08 15:39
脂肪酶是最早被人类发现、研究和利用的酶类之一,现已在食品,医药,能源等行业中广泛应用。其中,利用其位置专一性生产高附加值结构脂以及其介导的化学酶法生产环氧和内酯型化合物更是极具经济效应和前景的两个应用方向。但是,在相关领域的生产实践中,现有脂肪酶的催化性能还无法满足绿色制造的全部需求,而酶的改造常常使用结果无法预知的定向进化来完成。因此,为了避免冗长而随机的筛选过程,需要解析相应的分子机制来指导脂肪酶的改造。而且在后基因组时代,分子机制的解析也能提高具有特定属性的新酶的挖掘效率。本论文以来源于Streptomyces sp.strain W007和Penicillium camembertii的脂肪酶（简称为MAS1和PCL脂肪酶）为研究对象,综合运用生物计算、分子生物学及生化表征技术来探究脂肪酶位置选择性的分子机制和H2O2驱使脂肪酶失活的机制并提出和验证了位置选择性改造和H2O2耐受性提升策略。同时,也为酶的机制研究和改造提供了新的思路。具体研究内容和结果如下:一、MAS1脂肪酶无位置选择性的分...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
酶制剂的市场规模及增长率
过协同效应大幅提高酶的热稳定性（有叠加12个正向突变的突变体的Tm值增加了22℃，其最适反应温度也提高了20℃以上[44]）。对于提升酶的溶剂耐受和化学变性剂耐受而言，人们似乎还没有找到更加行之有效的方法。时下，很多科研工作者将耐受型和不耐受型同源蛋白的动力学轨迹进行比较，以此来判断与酶的耐受性相关的结构特征，或者照搬热稳定性提升的一套来进行设计改造。[47,48]因此，寻找更行之有效的改造策略来打破定向进化在酶的溶剂耐受和化学变性剂耐受提升研究领域中的主导地位就变得十分有意义了。[49-53]图1-2FRESCO的突变位点筛选流程。[44]Fig.1-2TheprocessofscreeningformutantionsiteinFRESCOmethod.[44]
华南理工大学博士学位论文8图1-3RML脂肪酶的（A）闭合（PDBID:3TGL）和（B）开放（PDBID:4TGL）状态。催化三联体和氧负离子洞及抑制剂以棍棒模型显示，粉色虚线表示氢键。Fig.1-3The(A)closed(PDBID:3TGL)and(B)open(PDBID:4TGL)stateofRML.Thecatalytictriad,oxyianholeandinhibitorwereshownasstick.Thepinkdashrepresentedhydrogenbond.1.3.2脂肪酶的催化机制如前所述，脂肪酶是一类具有α/β水解酶折叠结构特征且以Ser-His-Asp催化三联体作为催化活性位点的酶。目前发现共有17种不同类型的酶具备这些种特点，不过它们的催化机制却不尽相同。[69]主要区别在于催化过程中是否形成酰酶复合物，有酰酶复合物形成的一类称为类水解酶型，无酰酶复合物形成的一类称为类裂解酶型，其详细的差异见图1-4。本文中将被探讨的脂肪酶催化水解和过水解反应（图1-5）的过程都属于类水解酶型（酸碱催化）。该过程中催化丝氨酸的羟基质子转移到催化组氨酸上后Oγ原子亲核进攻脂质中带正电荷的羰基碳形成正四面体中间产物，然后催化三联体中组氨酸抢夺的质子转移至脂质的醚氧原子上使其与羰基碳之间的单键断裂形成酰酶复合物和产物醇（或水）；此时，第二个含羟基的底物分子经过催化组氨酸去质子化激活后亲核进攻酰酶复合物的羰基碳形成第二个正四面体中间产物，然后催化组氨酸上的质子转移至催化组氨酸Oγ原子上使该原子与羰基碳之间的单键断裂，最后另一个产物被释放，催化丝氨酸被还原，从而完成整个反应过程（图1-6）。[70,71]因为每个酶的序列和结构都有一定的差异，所以虽然同为脂肪酶，但是它们结合底物的方式可能会存在差异，因此催化机制也会存在细节上的差异。在后续的研究中，我们以实际的脂肪酶为例，详细地分析和讨论酶催化的水解和过
【参考文献】：
期刊论文
[1]TLL脂肪酶C末端修饰对其底物选择性的调节作用[J]. 谭熙钰,赵泽鑫,杨博,王永华. 现代食品科技. 2018(11)
硕士论文
[1]一种高过氧化氢耐受性脂肪酶突变体的构建策略及其催化环氧化反应的研究[D]. 谭熙钰.华南理工大学 2018
[2]脂肪酶MAS1的结构与耐热及底物选择性关系的研究[D]. 赵泽鑫.华南理工大学 2017
本文编号：3576823
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
酶制剂的市场规模及增长率
过协同效应大幅提高酶的热稳定性（有叠加12个正向突变的突变体的Tm值增加了22℃，其最适反应温度也提高了20℃以上[44]）。对于提升酶的溶剂耐受和化学变性剂耐受而言，人们似乎还没有找到更加行之有效的方法。时下，很多科研工作者将耐受型和不耐受型同源蛋白的动力学轨迹进行比较，以此来判断与酶的耐受性相关的结构特征，或者照搬热稳定性提升的一套来进行设计改造。[47,48]因此，寻找更行之有效的改造策略来打破定向进化在酶的溶剂耐受和化学变性剂耐受提升研究领域中的主导地位就变得十分有意义了。[49-53]图1-2FRESCO的突变位点筛选流程。[44]Fig.1-2TheprocessofscreeningformutantionsiteinFRESCOmethod.[44]
华南理工大学博士学位论文8图1-3RML脂肪酶的（A）闭合（PDBID:3TGL）和（B）开放（PDBID:4TGL）状态。催化三联体和氧负离子洞及抑制剂以棍棒模型显示，粉色虚线表示氢键。Fig.1-3The(A)closed(PDBID:3TGL)and(B)open(PDBID:4TGL)stateofRML.Thecatalytictriad,oxyianholeandinhibitorwereshownasstick.Thepinkdashrepresentedhydrogenbond.1.3.2脂肪酶的催化机制如前所述，脂肪酶是一类具有α/β水解酶折叠结构特征且以Ser-His-Asp催化三联体作为催化活性位点的酶。目前发现共有17种不同类型的酶具备这些种特点，不过它们的催化机制却不尽相同。[69]主要区别在于催化过程中是否形成酰酶复合物，有酰酶复合物形成的一类称为类水解酶型，无酰酶复合物形成的一类称为类裂解酶型，其详细的差异见图1-4。本文中将被探讨的脂肪酶催化水解和过水解反应（图1-5）的过程都属于类水解酶型（酸碱催化）。该过程中催化丝氨酸的羟基质子转移到催化组氨酸上后Oγ原子亲核进攻脂质中带正电荷的羰基碳形成正四面体中间产物，然后催化三联体中组氨酸抢夺的质子转移至脂质的醚氧原子上使其与羰基碳之间的单键断裂形成酰酶复合物和产物醇（或水）；此时，第二个含羟基的底物分子经过催化组氨酸去质子化激活后亲核进攻酰酶复合物的羰基碳形成第二个正四面体中间产物，然后催化组氨酸上的质子转移至催化组氨酸Oγ原子上使该原子与羰基碳之间的单键断裂，最后另一个产物被释放，催化丝氨酸被还原，从而完成整个反应过程（图1-6）。[70,71]因为每个酶的序列和结构都有一定的差异，所以虽然同为脂肪酶，但是它们结合底物的方式可能会存在差异，因此催化机制也会存在细节上的差异。在后续的研究中，我们以实际的脂肪酶为例，详细地分析和讨论酶催化的水解和过
【参考文献】：
期刊论文
[1]TLL脂肪酶C末端修饰对其底物选择性的调节作用[J]. 谭熙钰,赵泽鑫,杨博,王永华. 现代食品科技. 2018(11)
硕士论文
[1]一种高过氧化氢耐受性脂肪酶突变体的构建策略及其催化环氧化反应的研究[D]. 谭熙钰.华南理工大学 2018
[2]脂肪酶MAS1的结构与耐热及底物选择性关系的研究[D]. 赵泽鑫.华南理工大学 2017
本文编号：3576823
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