冷鲜猪肉中微生物多样性和优势腐败菌分子检测技术研究

发布时间：2020-05-07 20:21

【摘要】：当前,由微生物引发的食品腐败问题已成为食品行业关注的重点。猪肉作为我国肉类产品中主要的消费对象,其丰富的营养成分为微生物生长提供了充足的物质基础。由于猪肉在宰杀、储藏、加工等过程中都不可避免的被微生物污染,因此猪肉极易腐败。猪肉的腐败不仅会造成巨大的经济损失,甚至也会引发肉品安全问题。本论文以冷鲜猪肉为研究对象,分析了冷鲜猪肉新鲜度随储存时间的变化,并基于高通量测序技术解析储存期间微生物多样性,明确了冷鲜猪肉储藏过程中的优势腐败微生物,同时建立了基于属水平上检测优势腐败微生物的荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和实时荧光环介导等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermal amplification techniques,LAMP)。本论文对超市中冷鲜猪肉储藏过程中的感官品质、pH、挥发性盐基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)、菌落总数和微生物多样性进行了分析。通过对16S rDNA序列的V3-V4区进行高通量测序分析,共鉴定出微生物分别属于21个门、259个属。结果表明,随储存时间的变化,微生物群落组成和多样性发生了明显变化。储存5天后,发现假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和发光杆菌属(Photobacterium)成为优势微生物,尤其是发光杆菌属,先前的研究中很少报道与肉类腐败有关。研究结果表明,以上三类微生物与冷鲜猪肉的腐败有关。储存期间,pH和TVB-N的变化趋势相似;此外,随着菌落数持续增加,感官评分持续下降。菌落数、pH、TVB-N和感官评分的变化结果表明冷鲜猪肉在储存第5天时已为非新鲜肉。采用比较基因组学的方法,对优势腐败微生物假单胞菌成功筛选出了新的属内特异性基因sucD,该基因是琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的编码基因。针对sucD基因设计特异性引物,对其特异性进行验证,并优化qPCR反应的退火温度。以细菌纯培养物的基因组DNA为标准品,建立了qPCR标准曲线。结果表明,仅12株假单胞菌出现大小相符的DNA扩增条带,其它22株非假单胞菌均无扩增条带,表明qPCR的引物特异性好;最佳退火温度60℃。qPCR的标准曲线为y=-3.2034x+40.3640,R~2=0.9956,扩增效率为105%,纯培养物的灵敏度为8.1×10~2 CFU/mL,人工污染样品的检出限为7.8×10~3CFU/g,人工污染样品的qPCR检测结果和平板计数之间的Pearson相关系数为0.9980,相关性好。根据假单胞菌16S rDNA序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,基于实时荧光检测仪建立并优化了假单胞菌属实时荧光LAMP检测技术。通过12株假单胞菌和23株非假单胞菌对引物特异性进行了验证,并比较了实时荧光LAMP与普通LAMP检测技术的灵敏度差异,同时对人工污染样品的检出限进行了测定。研究结果显示,12株假单胞菌为阳性,23株非假单胞菌为阴性,表明实时荧光LAMP的引物特异性高;反应的最佳体系浓度为:6 mmol/L Mg~(2+),1.0 mmol/L dNTPs,0.30 mol/L甜菜碱,F3/B3:LF:FIP/BIP=1:4:8(1=0.2μmol/L),退火温度为65℃。实时荧光LAMP检测细菌纯培养物的灵敏度为3.2×10~1 CFU/mL,是普通LAMP检测灵敏度的10倍。人工污染样品的检出限为1.7×10~3 CFU/g,实时荧光LAMP技术可在2.5 h内完成冷鲜猪肉中假单胞菌的检测。
【图文】：

LAMP扩增原理图

15图 2-1 4℃储存期间冷鲜猪肉 pH 和 TVB-N 的变化Fig. 2-1 Changes in pH and TVB-N of refrigerated pork during storage at 4℃注：（A）pH 变化；（B）TVB-N 变化。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS251.51

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