基于Shewanella baltica氨基酸代谢探究冷藏大黄鱼腐胺的形成及消长机制

发布时间：2020-05-09 17:26

【摘要】：生物胺(Biogenic amine,BA)是一类具有生物活性的低分子量含氮有机化合物的总称,广泛存在于富含蛋白质和氨基酸的水产品中。大黄鱼(Pseudosciaena crocea)作为我国重要的经济鱼类之一,国内市场需求量不断增长,但由于其富含水分和多种可溶性蛋白,极易在贮藏、加工及流通过程中滋生微生物进而分解鱼体内含氮物质产生大量生物胺,导致产品腐败,造成极大的经济损失、资源浪费和环境污染。目前有关大黄鱼中生物胺的产生特性及其消长机理尚未明确,因此本实验开展由特定腐败微生物介导的冷藏大黄鱼主要生物胺形成机制的探究和解析,旨在为有效进行大黄鱼品质变化监控和腐败靶向抑制提供一定的理论基础和保障。主要研究内容包含以下四个方面:(1)本课题动态检测了养殖大黄鱼冷藏过程中的生物胺含量、菌落总数、典型理化指标(pH、TVB-N、TMA、P.I.%)及游离氨基酸含量变化,分析发现腐胺和尸胺是大黄鱼的主要生物胺,且两者含量之和可取代生物胺指标(BAI = Put + Cad + Him + Tym)来更快更直接地评估大黄鱼的新鲜度;我们进一步通过构建腐胺和尸胺与理化指标的回归模型(RPut = 0.88,P0.05;RCad = 0.87,P0.05)解析了两者较强的致腐特性;而生物胺与其前体物质游离氨基酸的动态相关性分析初步预示了腐胺形成的相对复杂性。(2)本课题组前期鉴定得到大黄鱼中致腐能力较强的特定腐败菌S.baltica 73,基于前一章实验结果,本实验开展S.baltica 73中腐胺形成通路的探究。根据已有的腐胺代谢通路研究报道,经过同源序列比对及PCR验证,我们在S.baltica 73中鉴定得到11个编码腐胺通路代谢酶的基因,分别为ARG、ADC、AgDI、OCT、odc、speF、pptE、TF、TG、TH和PotI;进而围绕鸟氨酸脱羧酶这一关键限速酶所在的中心代谢通路(ODC体系),探究关键代谢物鸟氨酸和腐胺对该体系的诱导作用;并分别构建了AspeF和△potE缺失株,结合基因表达量检测和腐胺产量的动态监测,探究ODC体系的运作机制,解析了speF和potE基因在腐胺产生中的关键主导作用,并提出了S.baltica 73中“PUT正向调控”的腐胺积累模式。(3)基于ODC体系探索环境pH对S.baltica 73腐胺积累的诱导调节作用。通过5个不同pH(5.5,6.0,6.5,7.0,7.5)培养环境刺激,我们探究了不同环境pH诱导对S.baLTICA 73 ODC体系相关基因表达、胞内speF蛋白酶活性大小以及菌体产腐胺能力的影响。实验结果表明pH为5.5、6.0、6.5的酸性环境对speF与potE基因具有较强的诱导表达作用并在6.0时最为显著;5个不同培养条件下细胞内speF蛋白酶活性大小依次为6.06.57.05.57.5;相应的菌体产腐胺量分别为 536.74mg/L(pH = 5.5),679.16mg/L(pH = 6.0),604.25 mg/L(pH = 6.5),538.54 mg/L(pH = 7.0),340.91 mg/L(pH= 7.5);由此揭示了 S.balticA 73中弱酸环境(pH=6.0/6.5)诱导腐胺大量产生的机理。(4)从蛋白层面考虑,本实验利用亲和免疫富集结合质谱鉴定技术,检测了s.baltica73的乙酰化修饰水平,鉴定到1103个乙酰化修饰蛋白和2929个乙酰化位点;进一步的生物信息学分析显示乙酰化蛋白参与多种代谢通路,且搜寻验证了 ADC、OCT、speF这三个腐胺通路代谢酶都具有乙酰化修饰位点,推测该修饰可能对腐胺产生及积累具有一定调节作用;通过构建高保守性乙酰转移酶和去乙酰化酶的基因缺失株,我们初步探究了乙酰化修饰水平与腐胺产量的关系,对比结果分析发现乙酰化修饰强度与腐胺含量存在一定负相关性。综上所述,本课题研究结果表明冷藏大黄鱼主要生物胺为腐胺和尸胺,两者含量之和可评估鱼体鲜度;且以大黄鱼特定腐败菌S.baltica73为切入点,通过进一步探究其腐胺形成机理,阐述了菌体内“PUT正向调控”腐胺积累的运作机制;同时也揭示并解析了弱酸性环境诱导S.baltica 73腐胺大量产生的作用机理;最后S.baltica 73乙酰化修饰组学的初探也表明了乙酰化修饰水平与腐胺积累程度潜在的负向关联性。以上研究结果为水产品腐胺控制关键靶点的确定以及产品保鲜都提供了一定借鉴意义。
【图文】：

于４°Ｃ下静置６０１１！丨１１以去除脂肪及提取待测物质，离心（ｉｎ，４°Ｃ）过滤，重复提取沉淀两次，合并滤液并定容至５０ｍＬ。行高速离心（１３，０００Ｘｇ，１５ｍｉｎ，，４°Ｃ），上清液过０．２２ｎｍＰＶ动氨基酸分析仪进行检测分析。逡逑曲线制备：氨基酸混合标准品用０．１邋ＭＨＣＬ配制成１００邋｜ｉＭ溶测分析。逡逑据处理与分析逡逑重复六次，结果用平均值±标准偏差表示，数据统计分析用ＳＰＳＳ邋ｖ性分析、方差分析、显著性分析及回归分析，以Ｐ＜0．0５作为差采用Ｐｒｉｓｍ邋７．０绘画软件作图。逡逑与分析逡逑殖大黄鱼冷藏条件下ＴＶＣ变化情况逡逑

鱼体ｐＨ会有略微下降，但随着自身酶解作用以及微生物作用的加强，大量蛋白逡逑质发生降解产生各类含氮挥发性物质，致使ｐＨ逐渐上升。逡逑分析图２－２知，挥发性盐基氮在贮藏期间发生显著变化，在贮藏末期己经高逡逑达４０ｍｇ／１００ｇ。根据ＳＣ／Ｔ３１０１－２０１０《鲜大黄鱼、冻大黄鱼、鲜小黄鱼、冻小黄逡逑鱼》规定，大黄鱼一级鲜度标准为ＴＶＢ－Ｎ邋￡邋１３邋ｍｇ／１００ｇ，二级标准为ＴＶＢ－Ｎ邋Ｓ逡逑３０ｍｇ／１００ｇ，由此可知冷藏大黄鱼在第４天（ｌ３．１５ｍｇＭ００ｇ）己超出一级鲜度范逡逑围，在１Ｃ藏丨２天（３０ｍｇ／１００ｇ）时超达二级标准，彻底腐败变质。同样地，ＴＭＡ逡逑含量也在贮藏期间不断显著增加，从最初的１邋ｍｇ／１００ｇ到最后的１４２邋ｍｇ／１００ｇ，逡逑由此可见胺类物质随着贮藏时间的延长大量增多导致鱼体腐败，鱼腥味也明显增逡逑强。Ｐ．Ｉ．％为非蛋白氮在总氮中所占的百分比
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.4

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本文编号：2656482