十八碳不饱和脂肪酸对牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的影响

发布时间：2020-05-28 19:09

【摘要】：牛乳过敏已成为各国政府和公众广泛关注的食品安全问题之一。尽管已发现牛乳中超过30种具有潜在致敏性的蛋白,但α-乳白蛋白和β-乳球蛋白被公认为是主要的乳清蛋白过敏原。众所周知,人们摄取牛乳时,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白不以单一组分的形式存在,而是伴随着食物中的其他营养组分进入机体。据近年来研究表明,牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白可以结合食物基质中的油酸及其他C18不饱和脂肪酸形成具有抗肿瘤活性的复合物。然而,从牛乳过敏角度而言,牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白结合C18不饱和脂肪酸后,C18不饱和脂肪酸是否影响它们的致敏性仍是一个待解决的科学问题。本论文以牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白为研究对象,采用五种不同的C18不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、共轭亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸)制备脂肪酸-乳蛋白复合物,解析脂肪酸与乳蛋白的相互作用并检测复合物的特异性IgE结合力;利用体外构建的KU812细胞脱颗粒模型评估复合物的致敏性;通过体外静态模拟胃肠液消化模式探索复合物的消化稳定性,并解析消化产物的特异性IgE结合能力;基于BALB/c小鼠过敏模型检测一系列与过敏相关的活性物质,评价复合物的致敏性;最后针对致敏状态小鼠的肠道免疫细胞,检测肠道树突状细胞的抗原呈递作用以及T细胞不同亚群平衡分化的调控作用。通过综合评价复合物在过敏反应关键阶段中的免疫学功能,将诠释C18不饱和脂肪酸对牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的影响,为科学认知食品基质中乳蛋白的致敏性提供理论指导。研究的主要方法、结果及结论如下:1.选取牛乳α-乳白蛋白为模式蛋白,利用食品工业中的新型加工技术(辐照加工)处理α-乳白蛋白,构建体外人嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒模型以及BALB/c小鼠致敏模型评估α-乳白蛋白加工前后致敏性的变化,为后续进一步研究食物基质中脂肪酸如何影响牛乳蛋白的致敏性提供前期的方法学基础。流式细胞术结果表明,KU812细胞株表面能够高效表达高亲和力的IgE受体FcεRI,表达量高达30%,利用乳蛋白与FcεRI的结合诱导细胞脱颗粒,通过评价释放生物活性介质的能力判断乳蛋白致敏性的强弱。此外,通过构建的BALB/c小鼠致敏模型,建立了与过敏相关的效应细胞(肥大细胞和嗜碱性粒细胞)的流式检测方法,即腹水肥大细胞的表面标志物为FcεRI~+c-kit~+、外周血嗜碱性粒细胞的表面标志物为IgE~+CD200R~+CD4~-CD45R~-,为后续评价乳蛋白的致敏性提供一种动物实验方法。2.基于牛乳基质中C18不饱和脂肪酸能够结合牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白生成具有生物活性复合物的性质,制备脂肪酸-乳蛋白复合物。经过游离脂肪酸检测试剂盒的测定,复合物中脂肪酸与乳蛋白的最终结合摩尔比为6-10。利用电泳技术和光谱技术鉴定表明,C18不饱和脂肪酸能够诱导α-乳白蛋白和β-乳球蛋白发生空间结构改变,其中以三级结构最为显著,表现为蛋白结构的逐渐展开以及表面疏水性的逐渐增强。通过IgG/IgE结合能力以及小鼠嗜碱性粒细胞激活实验表明,随着脂肪酸不饱和程度的增加,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性以及IgE的结合能力呈上升趋势,其中以亚麻酸的影响最为显著。可见,C18不饱和脂肪酸能够诱导α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的蛋白结构发生改变,从而促进其抗原性以及IgE的结合能力的增加。3.基于C18不饱和脂肪酸中亚麻酸增强乳蛋白抗原性以及IgE的结合能力最为显著这一结果,选取亚麻酸为模式脂肪酸,利用非还原性SDS-PAGE与间接ELISA技术探索不同理化条件下(不同温度、不同时间、不同摩尔比)亚麻酸对乳蛋白电泳行为和IgG/IgE结合能力的影响。结果表明,随着温度的不断升高,亚麻酸促进乳蛋白形成的聚合物越来越明显,并且其IgG/IgE的结合能力也不断增强;然而随着时间与摩尔比的增加,亚麻酸-乳蛋白复合物的电泳行为和IgG/IgE结合能力并没有显著性的改变。此外,ELISA结果显示,亚麻酸在60~oC、30min、1:50条件下增强乳蛋白的IgG/IgE结合能力最强,并且通过扫描电镜、粒径以及zata电位结果发现,此条件下亚麻酸的加入导致α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的颗粒变大,粒径变大,并且稳定性更强,间接说明亚麻酸诱导乳蛋白发生了分子间的聚合,形成高聚物。可见,温度是影响亚麻酸诱导α-乳白蛋白和β-乳球蛋白形成聚合物以及促进IgG/IgE结合能力增强的最大因素。4.利用体外构建的人嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒模型,进一步评价C18不饱和脂肪酸对乳蛋白致敏性的影响。经过ELISA检测试剂盒的测定,发现脂肪酸-乳蛋白复合物能够增强KU812细胞脱颗粒,促进释放的生物活性介质(组胺、β-HEX和IL-6)水平的升高。流式细胞术检测KU812细胞活化脱颗粒时Lyn、Syk、NF-κB以及MAPK家族蛋白的表达情况,发现脂肪酸-乳蛋白复合物能够加强源头激酶Lyn、Syk蛋白的活性,促进下游磷酸化蛋白含量的增加,进而促进KU812细胞的活化。可见,C18不饱和脂肪酸能够通过激活IgE/FcεRI介导的信号通路诱导牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的增加。5.通过体外静态模拟婴幼儿与成人胃肠液消化模式探索脂肪酸-乳蛋白复合物的消化稳定性,探究C18不饱和脂肪酸对α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的影响。Tricine-SDS-PAGE以及IgE结合能力的结果显示,不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0和5.0)的模拟胃液对乳蛋白胃消化稳定性有较大影响,只有当模拟婴幼儿和成人胃液pH分别为3.0和2.0时,乳蛋白才逐渐被降解为10 kDa以下的小分子片段,并且随着胃肠消化时间的延长,小分子片段不断增加;此外,该条件下乳蛋白的胃肠消化产物IgE结合能力达到最低。因此,选取婴幼儿胃液pH 3.0和成年人胃液pH 2.0作为进一步探究脂肪酸-乳蛋白复合物消化稳定性的条件。脂肪酸-乳蛋白复合物经过胃肠消化后的结果显示,复合物分子不易被降解成小分子片段,具有耐消化性,并且胃肠消化产物具有较强的IgE结合能力,说明C18不饱和脂肪酸能够保护乳蛋白耐消化,致使其IgE结合能力的增加,促进致敏性的增强。6.以α-亚麻酸制备的脂肪酸-乳蛋白复合物为模式复合物,构建了食物致敏与激发的BALB/c小鼠模型,通过体液免疫、细胞免疫和效应细胞表达等方面评价α-亚麻酸对乳蛋白致敏性的影响。结果显示复合物致敏与激发组小鼠促进了外周血B细胞(B220~+)的激活、增加了血清中与Th2相关的特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a水平的表达以及抑制了与Th1相关的特异性抗体IgG2a水平;并且,观察到小鼠脾细胞中高效表达了CD4~+T淋巴细胞、高效分泌了Th2细胞因子以及抑制了Th1细胞因子的分泌和Tregs的表达。此外,α-亚麻酸还促进了乳蛋白对效应细胞的表达,主要表现在腹水粘膜肥大细胞的激活,以及释放的mMCP-1和组胺水平的显著性升高。最后,通过组织结构的分析表明,α-亚麻酸促进了乳蛋白产生过敏反应危及到了肠道与肺部组织的完整性。综合各项致敏性指标可知,α-亚麻酸能够促进乳蛋白发生小鼠系统性免疫反应,诱导过敏反应朝向Th2方向偏移,达到增强α-乳白蛋白和β-乳球蛋白致敏性的目的。7.分离小鼠肠道PP结和MLN,进一步利用流式细胞术鉴定α-亚麻酸-乳蛋白复合物对肠道粘膜免疫系统的影响。结果显示复合物致敏与激发组小鼠降低了肠道PP结和MLN中树突状细胞(DC)、Th1细胞以及Tregs的表达,反而增强了Th2细胞的表达。可见,α-亚麻酸能够促进肠道免疫细胞的变化,诱导乳蛋白的肠道免疫系统朝向Th2方向偏移,导致致敏性的增强。
【图文】：

牛乳,机制,过敏反应,超敏反应

组织损伤的 III 型超敏反应；以及由 T 细胞介导，单核/巨噬细胞和淋巴引起的症和组织损伤的 IV 型超敏反应。涉及 II 型牛乳过敏反应可诱发血小板减少；及 III 型和 IV 型过敏反应，可引起疱疹样皮炎、麸质致敏肠病、牛奶诱发肠出、食物诱发小肠结肠炎综合征、食物诱发吸收不良综合征等，以及引起过敏性炎、支气管哮喘过敏性皮炎、接触性皮炎过敏性紫癜等[18; 38; 39]。尽管牛乳过发应的发生机制可分为以上四种类型，但临床实际情况是复杂的，同一种牛乳原在不同条件下可引起不同类型的超敏反应，可由多种免疫损伤机制引起[40]。前，非 IgE 介导牛乳过敏的精确免疫学机制尚不清楚，仍需进一步的探讨和研。此外，与 IgE 介导的牛乳过敏反应相比，非 IgE 介导的牛乳过敏反应在儿童期的自然恢复率较高，但是在成人中却占有很高的比例，这说明了非 IgE 介导牛乳过敏反应主要发生在对牛乳敏感人群的生命后期[41; 42]。Zuberbier 等[43]通对德国不同年龄组的人群进行调查，验证了非 IgE 介导的牛乳过敏反应的发生随着年龄的增加而增加。然而，目前在成人与儿童中非 IgE 介导的牛乳过敏反的流行病学数据仍处于缺乏阶段。

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由 123 个氨基酸残基组成，结构中含有 4 个二硫键，种钙结合的紧密球形的单体球蛋白，属于溶菌酶家族白蛋白占乳清蛋白的 25%，由乳腺上皮细胞组成，它半乳糖转移酶系统合成乳糖，同时还可以与脂质膜、并且含有大量的必需氨基酸（63.2%），是一种较好的营与母乳乳白蛋白相比较，有 74%氨基酸残基相同化学性质相似[282]。 -乳白蛋白在蛋白结构、氨基酸菌酶同源性很高；在氨基酸水平上牛乳 -乳白蛋白与及 35.8%的一致性[283]。目前，关于 -乳白蛋白与脂肪两种模型，最有可能的结合区域是在 Ca2+结合区域，胶囊，致使牛乳 -乳白蛋白的结构发生了改变并在一的构象，如图 1.3A 所示[284]。此外，也有研究表明，位点在蛋白表面，随着 -乳白蛋白表面（Lys 5、1性的增加，，通过疏水作用与脂肪酸结合，如图 1.3B
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.1

【参考文献】