分支氨基酸促进纳他霉素生物合成的代谢调控研究

发布时间：2020-06-05 19:15

【摘要】：纳他霉素是一种生物防腐剂,其研究与使用逐渐引起人们的关注,并已成为当今食品保藏研究的热点。纳他霉素主要由纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌经发酵产生,是一种高效、广谱的多烯烃大环内酯类抗真菌抗生素,能有效地抑制酵母菌和霉菌的生长,具有低剂量、高效率、无嗅无味、适用pH范围广、专一性好和安全性高等特点,已被大多数国家批准为食品防腐剂在食品工业应用。添加分支氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)已被证明是提高微生物次级代谢产物的一种有效方式,该物质既可以作为碳源使用,也可以充当氮源利用,其代谢产物如乙酰CoA,丙酰CoA等是多烯大环内酯类物质生物合成的前体。目前,在纳他霉素发酵中关于添加分支氨基酸调控生物合成的研究较少,具体的调控机制更是有待深入的探究。本论文主要研究内容为:1.以Streptomyces natalensis HW-2为研究对象,考察了添加L-缬氨酸。L-亮氨酸和L-异亮氨酸对纳他霉素生物合成的影响,并优化出L-缬氨酸对纳他霉素生物合成的影响最大。在纳他霉素发酵至36 h时添加0.5 g/L L-缬氨酸,纳他霉素产量达到1.82 g/L,比对照组提高了80%。添加L-缬氨酸后引起菌体生物量降低和pH升高,而葡萄糖利用速率加快;胞内丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸羧化酶(PC)活性增强,柠檬酸合酶(CS)活力降低了33.6%;发酵液中丙酮酸、草酰乙酸和乙酰辅酶A的含量分别提高了80.5%、44.4%和47.4%,乙酸、丙酸和α-酮戊二酸的含量分别提高了17%、10.3%和15.6%,而柠檬酸的含量降低了22.5%。2.基于RNA-Seq技术对培养基中添加和未添加L-缬氨酸的S.natalensis HW-2的对数期前期、对数期后期和稳定期的前期进行转录组全测序。结果显示,发酵48 h,有201个基因上调,445个基因下调;发酵到60 h,147个基因上调,42个基因下调;发酵到84 h,45个基因上调,72个基因下调。GO分析显示差异表达的基因主要参与生物调控、代谢过程、细胞过程、膜组分、催化活性、运输等过程,主要表现在羧酸的生物合成和分解代谢、氨基酸的生物合成和代谢等出现了大量的富集。KEGG分析显示添加缬氨酸后在氨基酸的生物合成,脂肪酸代谢,碳代谢,C5支链二元酸代谢,丁酸盐和丙酸盐代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成及降解,戊糖磷酸途径等途径出现了富集。分别从糖酵解途径,戊糖磷酸途径,三羧酸循环等途径,对基因的转录水平进行分析。添加缬氨酸后,基因转录水平的变化,改变了碳的而流通量,为纳他霉素的生物合成提供了更多的前体物质。对编码纳他霉素生物合成的I型聚酮合酶基因簇的转录水平进行分析,发现基因簇转录水平差异表达不显著。对样品进行RT-PCR验证,实验结果与转录组数据基本一致,说明转录组数据是可靠的。3.S.natalensis HW-2中ilvH基因功能的验证,根据缬氨酸的合成途径和转录组数据,选择基因乙酰乳酸合酶的调节亚基(ilvH)为目的基因进行过表达,验证基因功能。乙酰乳酸合酶的活性受ilvH的调节,通过基因工程的方法,ilvH过表达的S.natalensis HW-2会提高纳他霉素的产量。从S.natalensis HW-2基因组中找到到了ilvH基因序列,设计引物克隆得到目的基因,以质粒pIB139为基础构建ilvH的过表达质粒。将重组质粒转化到ET12567(pUZ8002)中,通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移将目的基因整合到S.natalensis HW-2中,通过抗性筛选过表达突变株,并发酵检测纳他霉素的产量,ilvH过表达菌株较原始菌株纳他霉素产量提高37.93%。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS202.3

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