吡喃型蓝莓花青素苷元的制备及对HeLa细胞抑制作用和机制研究

发布时间：2020-06-11 20:45

【摘要】：本论文研究内容隶属吉林省科技厅十三五项目(JJKH201800 90KJ)。吡喃花青素是近二十多年来从陈年葡萄酒滤液中检测到的一种新型花青素衍生物,因其具有高稳定性而受到广泛关注,在食品、保健品中具有良好的应用前景。本文以长白山野生蓝莓为原料,提取制备了蓝莓花青素以及花青素苷元,将花青素苷元与丙酮反应合成了吡喃花青素苷元,并通过HPLC和HPLC-MS法对其成分和结构进行了分析鉴定。然后对吡喃花青素苷元的稳定性、抗氧化活性和对肿瘤细胞的抑制作用进行了比较分析,以人宫颈癌HeLa细胞株为体外细胞模型,探究了其对HeLa细胞的活性、形态、细胞周期分布、凋亡的影响,并分别用花青素苷元和蓝莓花青素作为对照样品进行了分析评价,最后利用Western blot技术对于HeLa细胞内相关蛋白表达水平变化进行了分析。主要研究如下:1、采用组合柱层析法从蓝莓果实中提取花青素和花青素苷元,再通过亲核加成反应,由花青素苷元与丙酮反应合成了吡喃花青素苷元,并优化合成方法,得到吡喃花青素苷元合成的最佳方法为:先将花青素苷元粉末以3.0mg/mL的浓度溶解在60%的乙醇水溶液中,再与3倍体积比的丙酮混合,用HCl溶液调整体系pH为3.0,在42℃的水域环境中避光反应15d。提取产物通过逐级分离纯化后用高效液相色谱对其进行定量分析,其中,蓝莓花青素、花青素苷元、吡喃花青素苷元的提取物纯度依次分别为63.5%、71.8%和70.2%。2、通过半制备高效液相色谱法对吡喃花青素苷元进行了提纯后,采用高效液相-质谱联用法对其组成和结构进行了分析和鉴定,利用质谱扫描碎片离子的质荷比,鉴定出了吡喃花青素苷元提取物中的5种组分,依出峰顺序分别为:甲基吡喃飞燕草素、甲基吡喃矢车菊素、甲基吡喃矮牵牛色素、甲基吡喃芍药色素与甲基吡喃锦葵色素。这正与花青素苷元提取物中的5组色素依次对应,并且与高效液相色谱法分析的结果相一致。3、对吡喃花青素苷元在不同pH、温度、加热时间和金属离子作用下稳定性以及对DPPH、ABTS~+自由基清除能力进行了研究。(1)pH稳定性研究结果表明:当溶液pH大于3.0时,花青素和花青素苷元的稳定性显著下降,而吡喃花青素苷元在3.0~9.0的酸碱度范围内,稳定性几乎保持不变;(2)热稳定性的研究表明:花青素和吡喃花青素苷元水溶液在不同加热温度和加热时间条件下的稳定性显著高于花青素苷元;(3)金属离子稳定性的研究表明:Fe~(3+)离子对于三种蓝莓花青素提取物都具有明显的褪色作用,而Na~+、Al~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)离子在较低浓度时则具有一定的增色效应,高浓度时也会降低样品的吸光度值,其中金属离子对花青素苷元的影响最大,吡喃花青素苷元和花青素则表现出更高的耐受性;(4)自由基清除能力的研究结果表明:以Trolox抗氧化当量为依据,三种花青素样品对DPPH、ABTS~+自由基有很强的清除能力,从强到弱依次为:花青素苷元吡喃花青素苷元花青素。4、通过用不同浓度的吡喃花青素苷元、花青素苷元和花青素提取物处理HeLa细胞后,以MTT法检测了其对细胞活力的影响,以Calcein-AM/PI双染色法观察了细胞死/活状态,并利用流式细胞仪,对细胞的周期和凋亡进行了检测,研究发现,用样品处理24h后细胞活力呈剂量依赖性下降,其中花青素苷元处理的HeLa细胞显示出最低的IC_(50)值(275.33±1.67μg/mL),其次是吡喃花青素苷元(IC_(50)值为536.91±2.03μg/mL),而花青素的毒性最小(IC_(50)值为1095.28±1.72μg/mL)。Calcein-AM/PI双染色研究结果与MTT法的毒性评价基本一致,均表明花青素苷元对HeLa细胞的抑制作用最强,其次是吡喃花青素苷元,花青素作用最弱。通过流式细胞仪检测发现,三种花青素样品能够引起HeLa细胞周期在G_2/M期发生阻滞,并且能显著通过诱导细胞凋亡来抑制HeLa细胞的增殖。5、通过蛋白质免疫印迹分析技术检测了HeLa细胞内相关蛋白(p53、p38-MAPK和Caspase-3)的表达水平变化。其中p53蛋白的表达水平通常被用作G_2/M期细胞周期停滞的标志物,并且p53和p38-MAPK的上调以及Caspase-3的激活说明HeLa细胞可能通过线粒体内的凋亡途径引发了细胞凋亡,从而抑制了HeLa细胞的增殖,为进一步阐明吡喃花青素苷元影响细胞周期阻滞和细胞凋亡的可能机制奠定了基础。
【图文】：

花青素苷,花青素,结构通式,糖苷

多家族的新型花青素衍生产物[23]。青素衍生物的研究起源于对酿造葡萄酒及酒渣中离纯化及鉴定的研究[24]，集中在新型衍生产物的径的确认方面[25]，，目前为止，对其生物活性功能的研结构和功能概述构特点研究Anthocyanin）是一类广泛分布于植物中的水溶性，是由花青素苷元（Anthocyanidin，羟基和甲基与一个或几个糖分子通过糖苷键连接而成的天然苯环，并由一个三碳结构联结，呈现 C6-C3-C6结示。

分子结构图,吡喃,花青素,分子结构

第 1 章绪论9图1.2 几种主要类型吡喃花青素的分子结构Fig.1.2 Molecular structure of several main typesof Pyranoanthocyanidin其不同种类的名称与它本身结构或发现方式都有关系，比如酚基型、甲基型，是以在C10位置的取代基的不同而命名的，而从Pinotage葡萄酒中分离鉴定的吡喃花青素，被命名为Pinotin型，从Port红酒中分离鉴定的吡喃花青素，则被命名为Portisins型。通常酒体中自然形成的吡喃花青素需要较长的时间，新制酒中几乎没有吡喃花青素的生成，这与酒体中花青素与糖类的次级代谢物反应有关，糖类发酵过程中产生的丙酮酸
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.63;TS264.4

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