皮肤模型的构建及在检测药物化妆品中的应用
发布时间：2020-06-11 21:53
【摘要】：皮肤模型建立的方法至今已有30余年的历史，伴随组织工程技术的发展，建立皮肤模型已从单层表皮模型到复层皮肤替代物日趋成熟。国内对于皮肤模型的研究尚处于起步阶段，使用中国人皮肤建立替代模型，是当前的研究重点。皮肤模型按照复杂程度分为上表皮模型、真皮模型和表皮—真皮（复层皮肤）模型3种。这些体外替代模型对于体内、体外的毒理学评价具有重要意义。本课题旨在使用原代皮肤角质细胞和成纤维细胞构建皮肤模型。首先，要选择合适生物材料作支架，并配制合适化学成分的培养基；继而，取人体正常无病变组织，进行原代角质细胞和成纤维细胞的分离培养；最后，待两种细胞达到最佳生长状态时，接种嵌入式培养皿中进行气液培养，以形成多层的、高度分化的器官性组织模型。进行模型验证首先要进行HE切片、免疫组化试验以观察模型生长状态；第二要使用已构建好的皮肤模型进行皮肤毒性检测，本研究受试物为欧洲替代实验确认中心规定的用于皮肤刺激性的物质中选取11种化学品，使用MTT法以及ELISA法检测皮肤模型IL-1α因子的释放量，以确定该模型的稳定性、敏感性和准确性，逐步建立皮肤毒性动物替代试验的方法和平台；最后，进行皮肤模型毒性评价的应用，选取药物化妆品8种，以评价该体系为基础，检测其毒性。 获得主要结果包括：（1）成功构建了2株不同年龄的成纤维细胞系；（2）使用鼠尾胶原构建了胶原支架；（3）构建了皮肤表皮模型；（4）HE染色和免疫组化试验观察模型与正常皮肤表皮相似；（5）模型验证过程中，与动物试验进行对比，准确率达70%；（6）在药物化妆品上成功进行了检测应用。
【图文】：
0.25%胰酶消化，计数 0.5-1×106。PBS 洗 2 和 FITC 标记的 Annexin-V（20 μg/mL）10 μL，室 μg/mL）5 μL，避光反应 5 min 后，加入 400 μL B 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1 h）， 同 及 PI 的一管作为阴性对照。培养医院泌尿外科手术后的成人包皮组织，用含双抗（素）浸泡 30 min，，去除血污并尽量去除皮下结缔℃消化过夜，次日分离表皮与真皮；弃去真皮， 1），置入 15 mL 离心管中，加入组织量 2-3 倍 0 min 后取出，向离心管中加入 5 mL 含 10% FB吹打，1000 rpm/min 离心 10 min 去除上清，再次加，弃去上清，Epilife 培养基重悬接种于铺被有重组7℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养；24 h 后换
e 第三代 f 第五代图 2 Fbs 形态学观察（×10）a：Fbs 分离后 48 h；b：Fbs 在 96 h 候逐渐呈成纤维状；c：Fbs 第 6 d 时；d：Fbs 第一次传代后培养 24 h；e：第三代 Fbs 生长状态良好；f：第五代 FbsFig.2 The morphological observation of human dermal fibroblasts by enzymatic digestion for passages（×10）a 48 hours; b 96hours; c 6 days; d after the first passage 24hours; e the third passage; f the fifth passage4.1.2 成纤维细胞 HE 染色观察成纤维细胞的形态呈梭形，靠近未消化完全组织块附近也可见大多角形和扁平星形等向外爬出。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1-2 个核仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流时，呈鱼卵样或漩涡状排列，细胞在 10 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现（图 3）。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TS974.1;Q813
【图文】：
0.25%胰酶消化，计数 0.5-1×106。PBS 洗 2 和 FITC 标记的 Annexin-V（20 μg/mL）10 μL，室 μg/mL）5 μL，避光反应 5 min 后，加入 400 μL B 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1 h）， 同 及 PI 的一管作为阴性对照。培养医院泌尿外科手术后的成人包皮组织，用含双抗（素）浸泡 30 min，，去除血污并尽量去除皮下结缔℃消化过夜，次日分离表皮与真皮；弃去真皮， 1），置入 15 mL 离心管中，加入组织量 2-3 倍 0 min 后取出，向离心管中加入 5 mL 含 10% FB吹打，1000 rpm/min 离心 10 min 去除上清，再次加，弃去上清，Epilife 培养基重悬接种于铺被有重组7℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养；24 h 后换
e 第三代 f 第五代图 2 Fbs 形态学观察（×10）a：Fbs 分离后 48 h；b：Fbs 在 96 h 候逐渐呈成纤维状；c：Fbs 第 6 d 时；d：Fbs 第一次传代后培养 24 h；e：第三代 Fbs 生长状态良好；f：第五代 FbsFig.2 The morphological observation of human dermal fibroblasts by enzymatic digestion for passages（×10）a 48 hours; b 96hours; c 6 days; d after the first passage 24hours; e the third passage; f the fifth passage4.1.2 成纤维细胞 HE 染色观察成纤维细胞的形态呈梭形，靠近未消化完全组织块附近也可见大多角形和扁平星形等向外爬出。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1-2 个核仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流时，呈鱼卵样或漩涡状排列，细胞在 10 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现（图 3）。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TS974.1;Q813
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本文编号：2708515
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