青梅中PPO活性蛋白的理化性质及钝化动力学研究

发布时间：2020-06-30 05:07

【摘要】：青梅中含有丰富的有机酸、维生素C、酚类等成分,是市场上梅子蜜饯、梅子酒、青梅汁、乌梅加工的原料。在青梅采后贮藏、加工过程中,具有多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活性的蛋白会催化酚类物质形成醌类物质,对青梅及其产品的感官特性、营养价值造成严重影响。因此,本课题对青梅中具有PPO活性的蛋白进行分离纯化,研究其理化性质和钝化动力学,为青梅加工及贮藏防止酶促褐变奠定理论基础。(1)以青梅为原料,通过柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L,pH 7.0)提取、饱和度80%的硫酸铵沉淀粗蛋白,再采用Hitrap DEAE FF离子交换和Superdex G-75凝胶过滤层析纯化出PPO活性蛋白,比活力达404033.02 U/mg,纯化倍数为122.2倍。SDS-PAGE电泳显示出分子量为28 kDa的单一条带,经质谱鉴定,青梅PPO活性蛋白属于类甜蛋白-1(TLP-1),是稳定的亲水性非膜蛋白。二级结构预测TLP-1中含有6.02%的α-螺旋,27.31%的β-折叠,以及66.67%的无规卷曲,荧光光谱分析TLP-1在348 nm处具有最大发射峰。(2)对TLP-1的理化性质进行研究,结果显示:TLP-1的最适底物是邻苯二酚,最适反应pH值为7.5,最适反应温度为30℃。亚硫酸氢钠是TLP-1的最佳抑制剂,0.1mmol/L以上的亚硫酸氢钠能完全抑制TLP-1的活性。1 mmol/L Fe~(2+)和1~10 mmol/L Cu~(2+)对TLP-1表现出激活作用,超过该浓度表现为抑制作用。Fe~(3+)、Al~(3+)、Ca~(2+)对TLP-1的抑制作用随浓度的增加而增强。(3)TLP-1对温度、超声波和压力的敏感性较低。50℃~85℃TP处理30 min,TLP-1的活性仍有55.30%~1.83%,90、95℃分别处理18 min、12 min使TLP-1完全失活。冰浴状态下控制温度低于10℃,500W USC处理30 min能使TLP-1完全失活,而不控温时,300W、400W和500W US处理15 min、6 min、4 min后温度上升至70℃、70℃、82℃,TLP-1完全失活。TP、US、USC钝化TLP-1的规律符合一级动力学失活模型,50~95℃下,TP钝化TLP-1的D值为120.58~8.37 min,Z_T值为40.82℃;100~500W下,USC钝化TLP-1的D值为87.90~20.56 min,Z_W值为625 W;US钝化TLP-1的D值为70.64~7.28 min,Z_W值为473.80 W。相比于TP和USC处理,US钝化TLP-1可以显著降低D值,并提高TLP-1对超声波的敏感性。HPP处理条件下,200 MPa和500 MPa处理能显著降低TLP-1的活性(p 0.05),但处理后最低活性也高于60%。100 MPa处理5~15 min、300 MPa处理20~30 min或400 MPa处理10~20 min,TLP-1活性显著升高(p 0.05)。通过缓冲液提取、硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析出青梅中具有PPO活性大蛋白为类甜蛋白-1(TLP-1),发挥PPO活性时最适反应条件与PPO相似。TLP-1属于防御蛋白,酸碱稳定性和热稳定性较PPO强,对温度、超声功率和压力的敏感性很低,工业生产中应提高温度、延长处理时间或采用高温结合超声波钝化TLP-1,防止青梅酶促褐变。
【学位授予单位】：西华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.1
【图文】：

蛋白,类甜蛋白,青梅,樱桃

图 2.6 PPO 活性蛋白纯化后的 SDS-PAGE 图谱SDS-PAGE pattern of protein with PPO activity after purification列分析白经 LC-MS/MS 质谱分析，对质谱结果用 Mascot 及 BLA配蛋白为青梅（Prunus mume）的类甜蛋白 1（TLP-1），配分值为 12710 分，蛋白覆盖率为 49.8%。TLP-1 的蛋白基酸为质谱鉴定到的肽段部分，图 2.8 为其中两个肽段的，将 TLP-1 与桃（Prunus pesica）、樱桃（Prunus avium）的 TLP 的氨基酸序列进行多重比对，结果如图 2.9。LGLTTLAILF FSGAHAAKIT FTNKCSYTVW PGTLTGDQTGISNFVDAP SPWSGRFFGR TRCSTDASGK FTCATADCAPPATLVEIT IAENGGQDFY DVSLVDGFNL PMSVAPQDVNAVCPAQL QVKGSDGSVI ACKSACLAFN QPQYCCTYSKIFKDQCP QAYSYAYDDK SSTFTCSGRP DYLITFCP图 2.7 TLP-1 的序列

质谱图

25图 2.8 ASTCPADVNAVCPAQLQVK 和 DQCPQAYSYAYDDK 的 MS/MS 质谱图Fig. 2.8 The mass spectrum of ASTCPADVNAVCPAQLQVK and DQCPQAYSYAYDDK

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