玫瑰黄链霉菌NKZ-259菌株的分离鉴定及其次级代谢产物的分析

发布时间：2020-07-26 17:23

【摘要】：植物生长调节剂是一类调控作物生长发育的物质,在提高作物产量、改善作物品质、增强作物抗逆性及延长农产品储藏期和保鲜等方面发挥着重要的作用。目前我国市场上使用的植物生长调节剂大部分是化学合成的,容易造成食品安全和环境污染等问题,因此,新型、绿色、高效的微生物源植物生长调节剂的研究迫在眉睫。本研究分离获得一株放线菌NKZ-259,生测试验发现该菌株发酵液对番茄、辣椒的生长具有明显的促进作用。在此基础上对该菌株进行全基因组比较分析,并通过液相色谱-质谱联用技术对其次级代谢产生的植物生长调节剂类物质进行检测,最后通过发酵培养基的优化来提高菌株次级代谢产生IAA的含量。研究结果如下:1、从青海省祁连山地区土壤中分离获得一株能产生吲哚乙酸(IAA)的放线菌NKZ-259,经16S rDNA鉴定,初步鉴定为玫瑰黄链霉菌NKZ-259(Streptomyces roseoflavus NKZ-259)。温室生物测定试验显示:使用NKZ-259发酵液灌根,番茄根长比对照增加了73%,鲜重和干重也有一定增加;大田生物测定试验显示:与对照相比,浇灌菌株发酵液后番茄的株高、茎粗、冠幅和果实最大直径分别增加了11.29%,21.05%,29.68%和14.86%,辣椒的株高、茎粗、冠幅和果实最大直径分别增加了13.58%,14.57%,16.04%和14.07%,由此表明NKZ-259菌株发酵液对番茄、辣椒的生长具有显著的促进作用。2、利用PacBio平台对NKZ-259菌株进行全基因组测序,得到该菌株全基因组为8081455bp,G-C含量为72.13%。将全基因组序列于antiSMASH数据库中进行比对分析,发现其全基因组共有35个次级代谢基因簇,包括非核糖体肽类、核苷类、丁内酯类、细菌素类、聚酮类、萜烯类和四氢嘧啶类。对该菌株全基因组进行KEGG基因注释及比较基因组分析,预测该菌株次级代谢可产生玉米素(zeatin,ZA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和脱落酸(abscisic acid,ABA)。3、制备NKZ-259菌株发酵液,采用有机溶剂萃取,硅胶柱层析和薄层层析法分离,液相色谱-质谱联用进行检测分析,发现该发酵液中有IAA、ABA和SA。从而验证了NKZ-259菌株次级代谢能够产生IAA、ABA和SA三种植物生长调节剂类物质,可能会产生ZA。4、采用单因子试验、Plackett-Burman试验设计、Central Composite Design结合响应面法对NKZ-259菌株发酵产生IAA的培养基进行优化,得到最优培养基为:L-色氨酸2.24 g/L,葡萄糖20.7 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L,可溶性淀粉10 g/L,蛋白胨3 g/L,硝酸钾4.5 g/L;采用优化后的培养基发酵产生IAA的含量为45.3774μg/mL,原始发酵培养基产生IAA的含量为11.64μg/mL,使用优化后的发酵培养基IAA含量提高了三倍。综上,本研究中分离得到的玫瑰黄链霉菌NKZ-259(Streptomyces roseoflavus NKZ-259),其发酵液对番茄、辣椒的生长具有明显的促进作用,经过全基因组注释、预测及比较分析结合液质联用检测,发现该菌株次级代谢能产生IAA、ABA和SA三种植物生长调节剂类物质,通过发酵培养基优化,明显提高了菌株次级代谢产生IAA的含量,为新型、绿色、高效的微生物源植物生长调节剂的开发奠定了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.6
【图文】：

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图 1.1 近四十年全球植物生长调节剂销售额Fig 1.1 the sales of global plant growth regulators in recent forty years（世界农化网）我国作为一个农业大国，人口众多而耕地面积却在逐年减少。为了满足人们日益增长，单位面积作物产量的提高尤为重要。一方面我们可以通过施用杀虫剂、杀菌剂、除草预防或减轻作物生长过程中病虫草害的影响，通过农业措施来降低自然灾害带来的损失方面调控好作物自身的生长发育十分关键。随着世界植物生长调节剂的迅速发展，我国长调节剂的研究也迅速开展，在 70 年代就已经取得了较大的成果（陶龙兴等，2001）世纪末，我国每年使用植物生长调节剂的种植面积已经位居世界之首。据中国农药协会统12 年我国植物生长调节剂的原药产量已达到 20,424.5 吨（折百），植物生长调节剂的制达到 12 万吨左右。至 2013 年底，“三证”齐全的植物生长调节剂生产企业有 147 家，药 10 个；2017 年底植物生长调节剂原药登记数量 22 个，比 2016 年明显增多，仅制剂有 100 个；2018 年 11 月 27 日，植物生长调剂原药登记较上年基本持平，制剂登记数量9 个（张成亮，2018），自 2013-2018 年我国植物生长调节剂登记数量处于不断增加的图 1.2），登记作物遍及粮食作物、经济作物、蔬菜、水果等方面（表 1.2）。

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图 1.2 2013-2018 年（截止 11 月 27 日）我国植物生长调节剂登记数量Fig 1.2 Number of registrations of plant growth regulators from 2013 to 2018 in China（中国农药信息网）表 1.2 我国植物生长调节剂已登记的作物种类Table 1.2 Registered crop species of plant growth regulators in China称登记作物霉酸菠菜柑橘梨葡萄芹菜水稻甘蔗枣树棉花哌摀甘薯马铃薯棉花烯利番茄柿子香蕉乙酸豆类番茄甘薯苹果葡萄壮素番茄丁灵烟草苯隆黄瓜葡萄甜瓜氰胺葡萄诱抗素葡萄水稻番茄小麦柑橘苯胺灵马铃薯酰芸苔素内酯黄瓜葡萄苔素内酯草莓白菜番茄柑橘黄瓜辣椒梨荔枝苹果葡萄香蕉

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NKZ-259DNA提取

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