四种食源性致病菌液相芯片xTAG技术检测方法的建立

发布时间：2020-07-30 19:40

【摘要】：当今的食品安全问题已经成为危害全世界公共卫生的重要组成部分,而食源性致病菌则是食品安全领域不容忽视的一个方面。目前针对食源性致病菌的常见检测方法包括传统检测方法,如病原微生物分离培养鉴定,免疫学检测方法,如酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay;ELISA),核酸类检测方法,如聚合酶链式反应法(Polymerase Chain Reaction,PCR)、环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等等。这些方法大多存在检测时间较长、操作步骤较为繁琐、需要人为主观因素判断等局限性。本研究以鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、布鲁氏杆菌(Brucella spp.)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和志贺氏菌(Shigella spp.)四种食品卫生和安全领域常见的食源性致病菌为检测对象,使用Luminex液相芯片(High-throughput Suspension Array)xTAG(Flexible Sequence-tagged,xTAG)技术,建立了四种食源性致病菌的快速检测方法。并进行了方法学评价实验及模拟样本检测。研究目的:建立鼠伤寒沙门氏菌、布鲁氏杆菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌四种食源性致病菌的液相芯片xTAG技术的快速检测方法,并对检测方法进行完整的方法学评价和模拟样本检测试验。研究方法:根据四种食源性致病菌的保守基因分别设计引物,在上游引物的5'端连接特定的TAG探针序列(与微球所修饰的anti-TAG探针序列反向互补)并使用C3间隔臂进行阻隔,下游引物5’端用生物素(Biotin)标记。分别提取四种致病菌基因组DNA后进行多重PCR试验并优化反应条件。将多重PCR扩增后的产物与微球杂交,再与链霉亲和素藻红蛋白(Streptavidin,R-Phycoerythrin Conjugate,SPAE)进行孵育结合后利用Luminex200液相芯片系统检测得到荧光中度值(MFI),并对该方法进行方法学评价试验(特异性、灵敏性、稳定性)。最后使用脱脂牛奶随机混合四种致病菌完成模拟样本检测试验,实现对检测方法特异性的再次验证。研究结果:成功建立液相芯片xTAG技术对鼠伤寒沙门氏菌、布鲁氏杆菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌这四种食源性致病菌的快速检测方法,多重PCR反应最适退火温度为52℃,微球杂交条件为:36℃,35min。SPAE孵育条件为38℃,40min。方法学评价实验结果显示,该检测方法特异性达到100%,四种致病菌菌液检测灵敏度均可达到1CFU/mL,同批次内五组重复实验之间变异系数(CV)均小于5%,不同批次的12组脱脂牛奶模拟模拟实际样本检测试验结果准确性为100%。所有阳性判定结果MFI值均≥5倍阴性对照组。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS207.4
【图文】：

.5 液相芯片技术的发展与应用液相芯片（Liquid chip）又称为多功能悬浮阵列（multi-analyte suspension array,M是高通量悬浮阵列（High-throughput Suspension Array）等，是20世界90年代中期由minex公司研究发开研制的一款新型高通量液相分析平台。液相芯片技术是融合了光点阵技术、免疫分析技术、流式细胞技术、荧光编码微球技术、最新的高速数字理技术及高通量分析于一体的新型生物分子检测技术[72-73]。1997年，Clinical Che志把液相芯片技术称为真正应用与临床的生物芯片，这项技术在2010年得到了美国品管理局（Food and DrugAdministration，FDA）的许可认证，成为第一个应用在多指标检测技术。Luminex不断进行技术革新和开发，在十多年期间先后推出了minex100、Luminex200（图1.1）和Flexmap3D。在步入后基因组时代，基于液相芯研发出高通量的分析检测应用平台，为生物和医学领域提供了强大的支持。

以荧光报告分子，这样就是上机检测。检测时，当单个微球通过检测通道时，仪器两种激光进行检测，621nm 处的红色激光可以激发微球表面的红色分类荧光，从而球的种类，511nm 出的绿色激光可以激发报告分子表面的绿色荧光，进而确定成功分子结合的微球数量等等信息，通过双色激光达到定性和定量的分析[75]。为了控制列与微球杂交的严格杂交条件，保持高度的特异性，增强信噪比，使结果更直观，片系统选择使用四甲基氯化铵缓冲液为（Tetramethyl ammonium chloride，TMAC）

综合征患者血液里与细胞活性相关的各类细胞因子，为确定这种疾病的诊断标志物进行了研究 。图1.3 液相芯片检测系统工作原理Fig 1.3 The working principle of the liquid chip detection system

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