酶促丝素接枝壳寡糖及其仿生矿化材料制备
发布时间：2020-07-31 10:32
【摘要】：丝素蛋白(Silk fibroin,SF)具有良好的物理机械性能、透气透湿性、可降解性和生物相容性,在组织工程和生物医用材料领域有潜在的应用。本文借助漆酶(Laccase)催化丝素蛋白接枝壳寡糖(COS),制备得到SF-g-COS膜材料;通过己糖激酶(Hexokinase)催化SF-g-COS膜材料中的COS磷酸化,结合仿生矿化在磷酸化膜材料表面沉积羟基磷灰石(HAp),制备丝素基仿生矿化材料,拓宽丝素基生物材料的应用范畴。研究首先选用丝素中酪氨酸的模型物对羟基苯乙酰胺(PHAD),考察了漆酶催化PHAD的自聚以及接枝COS的反应效果,借助超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UPLC-TQD)、核磁共振氢谱(~1H-NMR)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)分析产物结构。在此基础上,通过体积排阻色谱(SEC)、凝胶电泳(SDS-PAGE)和粒径分析漆酶催化丝素蛋白溶液接枝COS的交联效果,对比膜材料的抗氧化性、抗菌性、热性能和生物相容性。研究结果表明,漆酶可以催化PHAD形成自聚体,并与COS发生席夫碱和迈克尔加成反应;SDS-PAGE和SEC结果验证了丝素蛋白溶液经漆酶催化后,SF蛋白分子量增大,丝素蛋白分子间发生自交联和接枝COS反应,制备得到的SF-g-COS膜材料具有较好的抗氧化性和抗菌性。在SF-g-COS膜材料制备基础上,借助己糖激酶和三磷酸腺苷(ATP)催化COS磷酸化。采用高效液相色谱(HPLC)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和磷含量测试,探究酶促COS磷酸化的反应机制和作用效果。结果发现,己糖激酶可以催化COS中C6位的羟基磷酸化,并伴随着二磷酸腺苷(ADP)的生成;经己糖激酶磷酸化的COS的FT-IR结果中出现P=O和C-O-P的伸缩振动;SF-g-COS膜材料经过磷酸化处理后,磷含量明显增加。将磷酸化SF-g-COS膜材料在Ca/P溶液中进行交替法仿生矿化,借助X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)和表面能谱图像(EDS-Mapping),分析了表面矿物相HAp的沉积效果,结果表明磷酸化处理改善了丝素膜材料的矿化效果,磷酸化的SF-g-COS膜表面形成更多HAp结晶相。此外,MG-63成骨细胞在上述丝素基仿生矿化材料表面具有较好的增殖和黏附效果,材料具有良好的生物相容性,在组织工程材料领域有潜在应用前景。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS102.33
【图文】：
图 1-1 漆酶催化酚类接枝氨基化合物的反应机理Fig.1-1 The Schematic illustration of the laccase-assisted grafting of amide on phenol1.3.2 己糖激酶的催化机理己糖激酶（Hexokinase）的催化机理是在 ATP 和 Mg2+的参与下，能够将三磷酸腺苷（ATP）中的末位磷酸根转移到六元糖的 6 位羟基上，同时伴随着二磷酸腺苷（ADP）和 6-磷酸六元糖的生成[46]，其反应机理如图 1-2 所示。
1.2.3 可以看出，在仿生矿化过程中，增加有机质表面阴离子基团的数目更加有利于 Ca2+的配位，从而生成更多的羟基磷灰石。1.5 本课题研究的目的、意义和内容1.5.1 研究的目的和意义丝素蛋白作为一种可生物降解的天然高分子，已广泛应用于医学材料、生物传感器和日化产品加工等领域。采用生物酶法对丝素蛋白进行改性，不仅是一种安全环保的方法，而且能赋予丝素蛋白材料新的应用性能，具有很广泛的应用前景。为此，如图 1-3 所示，本课题借助漆酶催化 SF 蛋白与 COS 发生席夫碱和迈克尔加成反应，制备得到 SF-g-COS 复合材料；在此基础上，通过己糖激酶催化 COS 的 C6 位羟基磷酸化，在丝素蛋白的表面引入阴离子磷酸根基团，提高对仿生矿化液中钙离子的结合能力，即在后续交替仿生矿化，更能有效地诱导磷酸化 SF-g-COS 复合材料吸附钙离子，通过键合和有序沉积将更多规整的羟基磷灰石晶体沉积在材料的表面上。通过上述研究，旨在以生物酶法替代传统化学法，建立一种丝素基仿生矿化材料制备方法，拓展丝素蛋白在骨组织工程方面的应用。
图 2-1 不同浓度 COS 的标准曲线Fig.2-1 The standard curve of different concentration of COSSC 分析和热重法-微商热重法（TG-DTG）用 DSC Q200 差示扫描量热仪以 10°C /min 的升温速度在 0-300°C 范围内F 膜进行 DSC 分析。其中，样品质量约 5.0 mg，氮气流速 50.0 mL/min。用 TAQ500 热重分析仪将矿化前后的 SF 膜进行 TG/DTG 分析，在石英坩质量约为 5.0 mg，测试的升温范围为 30-650°C，升温速度为 10°C/min，mL/min。 抗氧化性能测试过 ABTS 法可评价通过不同处理后 SF 膜的抗氧化性能，其原理在于 AB作用下生成自由基 ABTS·+，如果样品能够使蓝色的 ABTS·+还原成无色，有降低过氧自由基的的作用。通过测定反应前后吸光度的变化，可定量表氧化性的大小[29]。BTS·+阳离子自由基的制备是将 7 mM 的 ABTS 和 2.45 mM 的过硫酸钾等
本文编号：2776352
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS102.33
【图文】：
图 1-1 漆酶催化酚类接枝氨基化合物的反应机理Fig.1-1 The Schematic illustration of the laccase-assisted grafting of amide on phenol1.3.2 己糖激酶的催化机理己糖激酶（Hexokinase）的催化机理是在 ATP 和 Mg2+的参与下，能够将三磷酸腺苷（ATP）中的末位磷酸根转移到六元糖的 6 位羟基上，同时伴随着二磷酸腺苷（ADP）和 6-磷酸六元糖的生成[46]，其反应机理如图 1-2 所示。
1.2.3 可以看出，在仿生矿化过程中，增加有机质表面阴离子基团的数目更加有利于 Ca2+的配位，从而生成更多的羟基磷灰石。1.5 本课题研究的目的、意义和内容1.5.1 研究的目的和意义丝素蛋白作为一种可生物降解的天然高分子，已广泛应用于医学材料、生物传感器和日化产品加工等领域。采用生物酶法对丝素蛋白进行改性，不仅是一种安全环保的方法，而且能赋予丝素蛋白材料新的应用性能，具有很广泛的应用前景。为此，如图 1-3 所示，本课题借助漆酶催化 SF 蛋白与 COS 发生席夫碱和迈克尔加成反应，制备得到 SF-g-COS 复合材料；在此基础上，通过己糖激酶催化 COS 的 C6 位羟基磷酸化，在丝素蛋白的表面引入阴离子磷酸根基团，提高对仿生矿化液中钙离子的结合能力，即在后续交替仿生矿化，更能有效地诱导磷酸化 SF-g-COS 复合材料吸附钙离子，通过键合和有序沉积将更多规整的羟基磷灰石晶体沉积在材料的表面上。通过上述研究，旨在以生物酶法替代传统化学法，建立一种丝素基仿生矿化材料制备方法，拓展丝素蛋白在骨组织工程方面的应用。
图 2-1 不同浓度 COS 的标准曲线Fig.2-1 The standard curve of different concentration of COSSC 分析和热重法-微商热重法（TG-DTG）用 DSC Q200 差示扫描量热仪以 10°C /min 的升温速度在 0-300°C 范围内F 膜进行 DSC 分析。其中，样品质量约 5.0 mg，氮气流速 50.0 mL/min。用 TAQ500 热重分析仪将矿化前后的 SF 膜进行 TG/DTG 分析，在石英坩质量约为 5.0 mg，测试的升温范围为 30-650°C，升温速度为 10°C/min，mL/min。 抗氧化性能测试过 ABTS 法可评价通过不同处理后 SF 膜的抗氧化性能，其原理在于 AB作用下生成自由基 ABTS·+，如果样品能够使蓝色的 ABTS·+还原成无色，有降低过氧自由基的的作用。通过测定反应前后吸光度的变化，可定量表氧化性的大小[29]。BTS·+阳离子自由基的制备是将 7 mM 的 ABTS 和 2.45 mM 的过硫酸钾等
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