辣木精油对单核增生李斯特菌的抗菌机制研究及其在奶酪储藏保鲜中的应用

发布时间：2020-08-05 22:46

【摘要】：单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种典型的食源性病原菌。在食用被其污染的食物后,将会引起败血症、脑膜炎甚至流产,致死率高达30%。本课题以辣木精油(MO,Moringa oil)为抗菌保鲜剂,探究了MO对单核增生李斯特菌的抗菌机制以及MO在奶酪储藏保鲜中的应用。抗菌机制的研究以MO的抗菌性能为基础,深入地探究了MO对单核增生李斯特菌细胞结构、生理代谢及遗传物质的作用。MO在奶酪储藏保鲜中的应用从抗菌保鲜应用、色度评价、质构分析以及感官评定四个方面进行评价。主要研究成果如下:(1)通过GC-MS分析,MO的主要成分为棕榈酸,占比38.67%。MO对单核增生李斯特菌的MIC和MBC均为10.0 mg/mL。TEM结果表明,MO作用后,单核增生李斯特菌的细胞膜完整性遭到破坏。细胞膜通透性、电导率和表面电荷均显著增加,表明细胞膜受到严重的破坏,从而导致胞内蛋白质及可溶性蛋白大量泄漏。(2)MO作用于单核增生李斯特菌后,胞内关键酶(碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶)活性均有显著下降。同时,单核增生李斯特菌的能量代谢受到显著抑制,ATP含量和ATP酶活性有显著性下降。通过刃天青法测试菌体的新陈代谢活力,结果表明MIC浓度MO处理后,菌体新陈代谢活力下降了72%。MO抑制的呼吸代谢途径为糖酵解途径(EMP),且对糖酵解途径的三个关键酶己糖激酶(HK)、果糖磷酸激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)的活性有显著抑制作用。(3)MO作用后,单核增生李斯特菌胞内DNA流失严重,与LSCM观察结果一致。琼脂糖凝胶电泳结果表明MO对拓扑异构酶I/II的活性有抑制作用。通过紫外吸收光谱实验可知,MO与DNA的相互作用方式为嵌入结合作用。荧光定量PCR技术表明,MO对LPI-1毒力岛(prfA、plcA、hly、actA、plcB)和LPI-2毒力岛(inlA、inlB)均有不同程度的抑制作用,但MO对LPI-1毒力岛mpl基因没有抑制作用,可能的原因是MO不调控mpl基因的表达。(4)MO能够有效抑制单核增生李斯特菌的生长,并延长奶酪的货架期。4°C储藏14 d后,阴性对照组细菌增加了4.79 log CFU/g;而经过MO处理的四种奶酪,细菌数量增加缓慢。马苏里拉奶酪、切达奶酪、帕尔玛奶酪以及卡蒙贝尔奶酪的细菌数量仅分别增加了1.48 log CFU/g、1.51 log CFU/g、1.42 log CFU/g和1.35 log CFU/g。12°C储藏7 d后,阴性对照组细菌增加了5.03 log CFU/g,而马苏里拉奶酪、切达奶酪、帕尔玛奶酪以及卡蒙贝尔奶酪的细菌数量仅分别增加了2.09 log CFU/g、2.18 log CFU/g、2.14 log CFU/g和2.11 log CFU/g。在储藏过程中,色度评价、质构分析和感官评定结果表明MO不会对奶酪产生不良影响,而且能够有效维持其品质。因此,MO作为天然抗菌剂,在食品储藏保鲜领域具有广阔的前景。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.26
【图文】：

致病机理

染的概率更高。一旦感染单核增生李斯特菌，严重程度将从轻度肠胃炎到可怕的感染，如败血症，脑膜炎甚至流产，致死率高达 30%[18]。因此，单核增生李斯特菌的危害性及危险性引起了世界范围的广泛关注及深入研究。1.2.2 单核增生李斯特菌的致病机理单核增生李斯特菌的致病机理是一一突破三道屏障，分别为肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障，最终达到入侵宿主的目的[19]。具体步骤如下：（1）单核增生李斯特菌随食物进入肠道，在内化素蛋白 InlA 和 InlB 的作用下黏附在宿主细胞表面；（2）被宿主细胞膜内吞后，形成单核吞噬泡；（3）通过膜裂解因子 LLO、PlcA和 PlcB 裂解吞噬体膜，进入宿主细胞胞浆，利用胞浆内的营养物质进行增殖；（4）细菌表面的 ActA 通过聚集、激活肌动蛋白，使得单核增生李斯特菌在胞浆内运动；（5）向邻近细胞迁移，此时的细菌为双膜吞噬泡结构；（6）进入邻近细胞，在膜裂解因子的作用下，再次进行新的感染周期（图 1.1）[20]。

毒力基因,鼻咽喉,毒力因子,持家基因

还包括如下三种感染途径：（1）通过皮肤传播，如兽医、农场工作者等直接接触单核增生李斯特菌的感染概率较大[21]；（2）单核增生李斯特菌经口腔、鼻咽喉和眼睛等部位的神经末梢后，通过细胞间迁移经过脑神经直接上行至后脑[22]；（3）通过母婴之间的胎盘垂直传播，胎儿患病几率增大[23]。1.2.3 单核增生李斯特菌的毒力基因在单核增生李斯特菌粘附侵袭、吞噬体逃逸、胞内增殖和胞间迁移时，其建立感染的每一个环节都有特定毒力基因的介导。研究人员发现，目前分离的所有单核增生李斯特菌都有 LPI-1 毒力岛（Listeria pathogenicity island 1）。LPI-1 毒力岛是最重要的毒力岛，由 6 个主要毒力因子编码基因构成，分别为 prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB，两端有持家基因，分别为 prs 和 ldh[24]（如图 1.2 所示）。

卵磷脂酶,吞噬体,宿主细胞,宿主

菌最重要的毒力调控因子，在细菌的粘附侵袭、吞噬体逃逸、胞内移过程中都离不开 PrfA 因子的介导[25]。在单核增生李斯特菌入侵李斯特菌溶血素 O（LLO，ListeriolysinO，由 hly 基因编码）、磷脂磷脂酶 PI-PLC（PlcA，由 plcA 基因编码）和卵磷脂酶 PC-PLC（Pl基因编码）均参与裂解吞噬体膜[26]。mpl 基因编码锌依赖金属蛋白酶pl 通过裂解卵磷脂酶 C（PC-PLC）无活性前体的氨基端，使得卵磷而参与裂解宿主细胞的吞噬泡膜[27]。ActA（由 actA 基因编码）是聚集因子，主要作用为聚集宿主细胞肌动蛋白并促进单核增生李斯的迁移、扩散[28]。正是由于 ActA 的帮助，使得单核增生李斯特菌宿主的“外套”，从而不被宿主的免疫系统识别、攻击，逃脱自噬毒力岛两端为持家基因，prs 基因编码磷酸核糖焦磷酸盐合成酶，ld酸脱氢酶[29]。

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