鳕鱼皮胶原蛋白肽对NAFLD的修复作用

发布时间：2020-08-11 09:57

【摘要】：非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝细胞内脂肪过度沉积,排除饮酒和其他明确的损肝因素导致的临床病理综合征,目前尚无确切和疗效显著的NAFLD治疗方法,尽管吡格列酮和维生素E得到国际社会的认可,但也存在一定的副作用。海洋生物活性肽具有功能独特、结构新颖的特点,利用海洋生物资源开发出生物活性功能肽是近年来研究的热门课题。鳕鱼(gadus)作为世界上捕获量最大的鱼类之一,其鱼肉常用于制作鳕鱼片,而鳕鱼皮则作为下脚料被丢弃。研究发现鳕鱼皮中含有丰富的胶原蛋白,提取的胶原蛋白活性肽已在很多领域得到了应用,但对NAFLD是否有修复作用目前尚未见报道。本实验应用酶解方法制备鳕鱼皮胶原蛋白肽(Cod skin collagen peptide,CSCP),研究其对NAFLD细胞模型和小鼠动物模型的修复作用,为开发一种新型的、对NAFLD有修复效果的护肝类保健品提供实验依据。本研究应用油酸对Chang liver细胞进行诱导,通过MTT法检测Chang liver细胞活性,倒置显微镜观察、油红O染色以及GPO-PAP酶法测定细胞中TG含量为指标建立体外NAFLD细胞模型。以NAFLD细胞中的TG含量为标准对鳕鱼皮进行最佳酶种筛选,应用单因素和正交实验确定酶解的最佳工艺,经超滤制备高活性的CSCP,探究其体外抗氧化能力。获得的CSCP作用于NAFLD细胞模型中,测定正常组、模型组、CSCP低剂量组(40μg/mL)和CSCP高剂量组(80μg/mL)培养液中AST、ALT、MDA、SOD、GSH、CAT、ROS含量变化;透射电镜观察细胞超微结构来评价CSCP对NAFLD细胞模型的修复作用。以小鼠为实验动物,分为正常组、模型组、洛伐他汀阳性对照组(剂量为8 mg/kg/d)、CSCP低剂量组(200 mg/kg/d)和CSCP高剂量组(400 mg/kg/d)。除正常组外,其它各组均在高脂饲料喂养建立的NAFLD小鼠模型上进行灌胃给药。观察小鼠的一般行为状态与体重变化,实验结束取血清与肝脏,计算肝重指数,测定小鼠血清中AST、ALT、HLD、DLD、TG的含量以及肝组织匀浆液中SOD的含量;HE染色和透射电镜判断小鼠肝脏的组织结构改变情况。实验结果:1.MTT法结果显示当油酸浓度为0.25 mmol/L,作用24 h后Chang liver细胞的存活率最高,倒置显微镜观察细胞中的空泡明显增多;油红O染色结果显示此时细胞中的脂滴出现了明显融合,且细胞生长形态较好;细胞中的TG含量明显升高,表明NAFLD细胞模型成功建立。2.制备CSCP的最佳酶解工艺为:碱性蛋白酶为最优酶种,料液比为1:2,pH值为9,加酶量2000 U/g,温度50℃,时间为10 h;制得的酶解液经超滤截留1 KDa的分子段,可使细胞中的TG含量显著降低,该分子段的多肽即为本实验所用的CSCP。3.CSCP的体外抗氧化结果显示,CSCP对DPPH、羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基具有较好的清除效果,表明CSCP具有很好的抗氧化活性。4.体外细胞实验结果显示,相比于模型组,CSCP加药组细胞中的AST、ALT、MDA、ROS的含量下降,且呈现剂量相关性,SOD、GSH、CAT的含量较模型组有所上升。透射电镜结果显示正常组细胞具有较多的微绒毛,而模型组细胞微绒毛数量减少,有明显脂滴。加药组细胞中脂滴含量明显减少,微绒毛数量明显增多,特别是高剂量组的变化更明显。5.体内小鼠动物实验结果显示,CSCP可降低模型组小鼠血清中AST、ALT、DLD和TG的含量,使HLD的含量升高,肝组织匀浆中SOD的含量有下降的趋势。HE染色结果显示,模型组小鼠肝细胞内出现较多的空泡脂滴,阳性药物组和CSCP药物组得到了较大改善,肝索结构与肝细胞形态接近于正常。透射电镜结果显示,模型组肝细胞内有许多电子密度较低的圆形脂肪滴颗粒,CSCP药物组和阳性药物组脂滴明显减少,线粒体增多,对肝组织修复作用明显。实验结论:当油酸浓度为0.25 mmol/L,作用Chang liver细胞24 h后可建立NAFLD细胞模型,经碱性蛋白酶酶解制备得到的1 kDa分子段的CSCP可以有效降低NAFLD细胞模型中AST、ALT、MDA和ROS的含量,升高细胞中SOD、GSH、CAT的含量,清除有害自由基,显示了较好的抗氧化活性;同时减轻了高脂饲料诱导建立的小鼠NAFLD模型中肝组织的病变程度,因此CSCP对NFALD具有较好的修复作用。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.9
【图文】：

油酸,细胞存活率,细胞

注：#与正常组比较，P<0.05图 2-1 不同浓度的油酸对细胞存活率的影响2-1 effect of different concentration of oleic acid on cell v镜下细胞形态结果细胞用不同浓度油酸诱导后的倒置显微镜形态的看到，相比于正常组细胞，油酸组细胞随着浓渐增多，在 0.25 mmol/L 时细胞生长形态相比较也明显增多。

倒置显微镜,细胞,油酸,形态

注：#与正常组比较，P<0.05图 2-1 不同浓度的油酸对细胞存活率的影响Fig. 2-1 effect of different concentration of oleic acid on cell viability2.3.2 倒置显微镜下细胞形态结果Chang liver 细胞用不同浓度油酸诱导后的倒置显微镜形态如图 2-2 所过图片可以明显的看到，相比于正常组细胞，油酸组细胞随着浓度的增大中的空泡数量逐渐增多，在 0.25 mmol/L 时细胞生长形态相比较其他细胞形好，细胞内空泡也明显增多。

脂滴,油酸,油红,浓度

鳕鱼皮胶原蛋白肽对 NAFLD 的修复作用2.3.3 油红 O 染色结果不同油酸浓度诱导 Chang liver 细胞的油红 O 染色结果如图 2-3 所示，正常组细胞呈上皮样形态，周围有突起，细胞伸展性好，细胞质内脂滴含量少，随着油酸浓度的增大，细胞中的红色颗粒（代表脂滴）数量明显增多。在 0.1 mmol/L的油酸浓度下细胞生长状态较好，细胞内的脂滴变较少；0.2 mmol/L 的油酸浓度下细胞发生损伤，细胞内脂滴含量开始增多，0.25 mmol/L 的油酸浓度下细胞形态发生了改变，细胞内脂滴增多，脂变明显，很多脂滴发生了融合。0.3 mmol/L、0.4 mmol/L 和 0.5 mmol/L 下随着油酸浓度的升高细胞中脂滴的含量也逐渐增多，且油酸的毒性也随之增大，细胞核固缩严重，细胞数量减少。根据结果最终确定油酸诱导的 NAFLD 细胞模型的最佳浓度为 0.25 mmol/L。

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