工业结晶母液糖中甜菊糖苷的回收及莱鲍迪苷A的酶法改性

发布时间：2020-08-19 11:38

【摘要】：甜菊糖苷是一类从甜叶菊中提取的非营养性、非发酵性高倍甜味剂。它具备天然无毒、低热高甜、性质稳定等优点,是一种在食品行业具有广阔发展前景的理想甜味剂。溶剂浸提是目前商业甜菊糖提取的主要工艺,该工艺最后经过结晶回收高纯度莱鲍迪苷A(RA)和甜菊苷(ST)之后,剩余母液通常经过喷干后成为粉末固体,称为母液糖(MLS),一般作为低价甜味剂销售。母液糖中含有60%的甜菊糖苷和一些残余的多酚、黄酮类杂质,这些杂质的存在不仅加重母液糖后苦味,而且影响糖苷的进一步回收。我国每年约产生2000 t母液糖,如果能够通过除杂使其纯度达到85%以上,价格可以提高2~3倍,本文针对上述问题,目标为建立一种操作简单、可工业化的从母液糖中回收甜菊糖苷的方法。此外,自甜菊糖苷酶法转化产物被批准使用后,甜菊糖苷的酶法修饰得到了广泛关注,尤其是比RA分别多一个和两个葡萄糖基的莱鲍迪苷D(RD)和莱鲍迪苷M(RM),它们具有更加优良的甜味性质,因此本文也尝试采用商业酶对RA进行酶法改性。首先,采用树脂法对母液糖进行纯化。优选非极性大孔树脂NDR-1作为吸附基质,静态吸附与解吸的研究结果表明,在25%(v/v)的乙醇溶液中,在pH 7.00、10~oC的条件下进行吸附,在30~oC、100%乙醇不调节pH的情况下等体积解吸,糖苷吸附率为92.24%,解吸率86.61%,杂质含量由母液糖中的34.13%降低至解吸液中的12.88%。基于静态吸附解吸的优化乙醇浓度,经过NDR-1树脂的动态层析(层析柱:1.1×100 cm),母液糖的杂质含量降低至4.78%,糖苷回收率为89.88%。进一步采用10×100 cm的玻璃层析柱处理300 g(干重)母液糖,杂质含量降低至13.79%,糖苷回收率为90.00%,验证了该方法的工业可行性。其次,采用甲醇重结晶母液糖结合树脂柱层析实现母液糖除杂。发现100%(v/v)甲醇对母液糖进行重结晶可以有效除杂,且不同结晶条件下可以得到不同糖苷组成的晶体,重结晶工艺优化结果显示:在料液比1:5,温度25~oC,搅拌时间24 h的条件下得到的晶体中杂质含量最低,为3.11%,结晶率为42.45%。对剩余母液采用大孔树脂NDR-1处理,在优化条件下(吸附溶剂为35%乙醇,原料树脂质量比1:10)进行动态层析(层析柱规格:1.1×100 cm),得到纯度为98.10%的甜菊糖苷,回收率为95.20%。将重结晶法和柱层析法联合用于母液糖的除杂中试,通过处理300 g(干重)母液糖,最终母液糖中甜菊糖苷的回收率达到94.18%,所得糖苷中杂质含量为2.83%。(经过层析处理后杂质含量为1.92%)。最后,以RA为受体,筛选转糖基酶和供体底物的结果表明,转化效率最高的酶和供体底物分别是纤维素酶(Trichoderma reesei)和纤维二糖,经条件优化(RA 10 g/L,纤维二糖100 g/L,酶浓度为2000 U/mL,温度70~oC,pH 3.97),得到RA转化率最高为36.05%,转化产物的味质得到了一定的改善。以纤维二糖为供体底物,RA经纤维素酶转化的产物分析结果显示,其主要的5种转糖基产物为单葡萄糖基-RA的同分异构体。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS202.3
【图文】：

甜菊糖苷,化学结构

图 1-1 甜菊糖苷的化学结构Fig. 1-1 Depictions of the chemical structure of steviol glycosides表 1-1 甜菊糖苷主要组分及相应性质Table 1-1 Main components and characters of steviol glycosides糖苷名称 R1（C-19） R2（C-13）相对分子质量相对甜度参考文献菊醇（steviol） H- -H 318.5 0 [24]甜菊双糖苷steviolbioside）H- Glc(β1-2)-Glc(β1 642.7 10~15 [25-28]甜菊苷（ST） Glc(β1- Glc(β1-2)Glc(β1- 804.9 270~300 [25, 26, 29]莱鲍迪苷 A（RA）Glc(β1-Glc(β1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-967 350 [30, 31]莱鲍迪苷 B（RB）H-Glc(β1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-804.9 10~15 [28, 32]莱鲍迪苷 C（RC）Glc(β1-Rha(α1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-951 40~60 [32]莱鲍迪苷 DGlc(β1-2)Glc(β1-Glc(β1-2)[Glc(β1-1129.2 150~250 [33, 34]

母液,乙醇,甲醇,现象

晶法结合层析法回收母液糖中的甜菊糖苷醇重结晶甜菊糖苷均具有一个疏水的双萜结构核心，不同的糖苷在 C-13 和 C-19 的糖单元，因此甜菊糖苷是一种双亲性化合物[5,115]。甜菊糖苷在极性不出不同的溶解性质，研究表明，在 5oC 下，纯水中 RA 的溶解度为 2.0~2.在无水甲醇或无水乙醇中，相同温度下 RA 的溶解度仅为 0.1~0.2g/100m乙醇中 RA 的溶解度则提高至 3.4~3.6 g/100 mL。这是因为在特定极性甜菊糖苷通过双萜结构之间的疏水相互作用，或糖单元上羟基之间的氢从溶剂中沉淀析出[117]。因此通过调节醇-水混合溶剂的比例可实现甜菊[85]，预实验中发现，室温下相同质量的母液糖在同等体积的甲醇和乙醇解，1 h 内甲醇中即有浑浊产生，随着搅拌时间的延长直至 40 h，甲醇断增加，乙醇中始终澄清透明（图 3-12），可能是由于母液糖是乙醇溶留在母液中的糖苷和杂质部分，该部分在乙醇中的溶解性较好，另外，的回收难度远大于单一醇溶剂，因此选择甲醇溶液作为结晶溶剂。

纤维素酶,总离子流,产物,质谱图

39 纤维素酶转化 RA 的 UPLC-MS 图谱（（a）SGs 的总离子流图；（b）-（g）RA 产物III，IV，V 的质谱图）Fig. 3-24 Negtive ion current chromatogram and the MS spectra of SGs in the mixture ofucosylation to stevioside. (a) Total ion chromatogram of the SGs. (b)-(g) MS spectrum of RIII, IV, V.图 3-23 中，纤维素酶转化 RA 的产物主要有三个色谱峰对应产物 1，2，苷产物总离子流图（图 3-24（a））中，保留时间为 2.52min 对应的色谱峰为修饰产物有五个峰，依次对应产物 I，II，III，IV，V，保留时间分别为 3.1in，3.67 min，3.85 min 和 4.36 min。通过 RA 转苷实验组和 RA 空白对-MS 结果对比发现，RA 不能够被纤维素酶水解，且在不添加供体底物纤维 RA 不能够发生转糖基反应。

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