鲣鱼降尿酸肽的制备分离、结构表征及功效机制研究

发布时间：2020-08-20 09:00

【摘要】：高尿酸血症目前已成为继糖尿病的第二大代谢疾病,然而目前临床上使用的降尿酸药物容易引起过敏反应,甚至导致严重的肝肾损伤,因此寻求更安全有效的天然降尿酸产品变得尤为重要。本文选取鲣鱼为原料,酶解后经分离纯化得到纯化组分Frc2,对其进行结构表征和体外黄嘌呤氧化酶(XO)抑制活性分析,研究多肽与XO相互作用的机制,并构建高尿酸血症细胞模型评价其降尿酸活性。采用木瓜蛋白酶水解鲣鱼蛋白,制备不同温度、pH和加酶量的8个差异样品,研究其蛋白质回收率、体外XO抑制活性、分子量分布和氨基酸含量,并探究不同检测指标之间的相关性。结果表明,当pH为7.0,温度为55℃,加酶量为1.00%时,鲣鱼蛋白酶解液的蛋白质回收率最高,而pH 7.0,温度55℃,加酶量为0.35%的鲣鱼蛋白酶解液的XO抑制活性最强。鲣鱼蛋白酶解液中多肽片段主要为分子量小于1000 Da的低聚肽,其分子量分布与XO抑制活性之间无相关性,而脂肪族氨基酸含量与XO抑制活性基本成负相关关系。以XO抑制活性为指标对鲣鱼蛋白酶解液进行分离纯化,采用阴离子交换层析柱和尺寸排阻凝胶过滤色谱柱分离纯化得到组分Frc2,在浓度为4 mg/mL时,XO抑制活性达到32.33%±6.38。结合高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)对Frc2进行结构表征,鉴定得到4条多肽序列:Pro-Gly-Ala-Cys-Ser-Asn(PGACSN),Trp-Met-Leu(WML),Ala-Met-Pro-Phe(AMPF)和Phe-Gly-Val-Gly(FGVG)。利用分子对接模拟技术研究多肽与XO相互作用的机制,其中多肽AMPF与FGVG均未与XO中关键氨基酸残基之间存在相互作用,而多肽PGACSN和WML均能嵌入到XO活性疏水腔内,尤其是多肽WML,几乎完全嵌入XO疏水腔中,并且二者均能与XO疏水腔中的关键氨基酸残基之间以氢键形式结合,其结合能分别为-4.51 kcal/mol和-7.34 kcal/mol。体外合成多肽PGACSN和WML具有很好的XO抑制活性,且20mmoL/L WML的XO抑制活性与20μmoL/L别嘌呤醇溶液相当。结合圆二色谱分析多肽与XO的相互作用,其结果与分子对接分析结果一致,多肽明显改变了XO的二级结构,尤其是多肽WML,表明多肽中的氨基酸残基与XO中的氨基酸残基之间发生了相互作用,且疏水性氨基酸可能与XO分子具有更好的亲和力。为了探究多肽在生物学上的降尿酸活性,采用腺苷诱导HK2细胞构建高尿酸血症细胞模型,诱导后细胞上清液中次黄嘌呤含量明显增加,但是上清液及裂解液中均未检测到尿酸。进一步研究发现,细胞中XO的表达量要远低于组织中XO的表达量。通过转染质粒pcDNA3.1 XDH提高HK2细胞中XO的表达量,采用腺苷诱导后,细胞上清液及细胞裂解液中次级代谢产物的变化与未转染细胞一致,仍未检测到尿酸。分析组织和细胞中尿酸水平和XO活性,结果发现10 mg组织中仅能检测到浓度为0.50μmol/L的尿酸,而未转染的细胞和转染的细胞由于XO表达量不足,检测不到尿酸的生成,且细胞中XO的活性低。最后,通过外源性XO结合腺苷构建高尿酸血症细胞模型,细胞上清液中次黄嘌呤完全转化为尿酸,尿酸水平显著升高。利用XO结合腺苷构建高尿酸血症细胞模型评价多肽PGACSN和WML的降尿酸活性,结果发现在浓度为2.50 mmol/L时,多肽PGACSN和WML均具有显著的降尿酸活性。上述结果表明,鲣鱼多肽具有很好的降尿酸功效,进一步研究开发鲣鱼多肽,可作为功能性食品或药品的辅料应用于缓解高尿酸血症及相关的疾病。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.4

【参考文献】