β-内酰胺酶生物传感器的制备及对牛奶中抗生素残留的检测研究

发布时间：2020-08-26 19:17

【摘要】：抗生素在畜牧养殖中使用广泛,存在过度使用情况,导致食品中(比如乳制品)存在抗生素残留,其中β-内酰胺类抗生素是最常见的,其可对人体健康和环境构成威胁。目前经常使用的抗生素残留检测方式具有一定的局限性,因而研究一种更为有效的检测方法极为重要。近年来生物传感器因其高灵敏度、响应迅速等优点,已成为一种重要的检测工具。金属改性介孔碳材料由于具有比表面积高、电催化性能优良等优点而广泛用于传感器性能的提高。亚甲基蓝(MB)具有高度共轭的环状结构和优异的电活性,可在电极表面形成具有导电性能的聚合物半导体薄膜,已广泛用于电极改性。青霉素酶(Pen X)和新德里金属-β-内酰胺酶-1(NDM-1)均属于β-内酰胺酶,能够水解β-内酰胺类抗生素中的β-内酰胺环从而导致抗生素水解失活。尤其是NDM-1能够催化水解除氨曲南外的所有β-内酰胺类抗生素,且目前在电化学检测方面应用较少。鉴于此,本文合成了金属改性介孔碳材料,并基于Pen X和NDM-1设计了三种生物传感器,完成了对β-内酰胺类抗生素模型青霉素钠(Pen G)和氨苄青霉素钠(AMP)的检测。1.两种金属基介孔碳材料的制备及性质探究利用自组装法和浸渍法制备钴掺杂介孔碳材料(Co@C)和硫化钴掺杂介孔碳材料(CoS_2@C),并对其羧基功能化得到COOH-Co@C和COOH-CoS_2@C。经由扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、X-射线衍射光谱(XRD)、氮气吸附脱附、傅里叶红外光谱(FTIR)和X-射线光电子能谱(XPS)等仪器表征,实现对所制备的Co@C和CoS_2@C材料的性质研究。结果表明Co@C和CoS_2@C稳定性良好、具备孔结构,且成功的进行了羧基改性。2.青霉素酶生物传感器的制备及应用利用共价结合法将Pen X固定在羧基功能化的介孔碳载体上得到Pen X-COOH-Co@C和Pen X-COOH-CoS_2@C。将MB电聚合到玻碳电极(GCE)上得到PMB/GCE,再利用固定化酶材料进一步修饰改性电极得到Pen X-COOH-Co@C/PMB/GCE和Pen X-COOH-CoS_2@C/PMB/GCE生物传感器。经过实验条件的优化,以Pen G为抗生素模型利用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测,结果显示Pen X-COOH-Co@C/PMB/GCE在Pen G浓度为0.1-10 ng·mL~(-1)时响应峰电流与Pen G浓度之间呈现良好的线性关系,线性方程为y=0.3811x+17.20(r~2=0.9974);在浓度范围为10-100 ng·mL~(-1)时两者也呈现良好的线性关系,线性方程为y=0.1170x+19.73(r~2=0.9959)。经计算,Pen X-COOH-Co@C/PMB/GCE对Pen G的检测限为0.64 ng·mL~(-1)(ppb)。在Pen X-COOH-CoS_2@C/PMB/GCE传感器中,响应峰电流在Pen G浓度为0.1-10 ng·mL~(-1)时呈现线性关系,线性方程为y=0.5642 x+21.57(r~2=0.9907);Pen G浓度为20-100 ng·mL~(-1)时也呈现线性关系,线性方程为y=0.0904x+25.91(r~2=0.9941),检测限为0.61 ng·mL~(-1)(ppb)。并利用两种传感器采用加标法成功实现了牛奶样品中Pen G的检测。3.NDM-1生物传感器的制备及应用将MB电聚合到GCE上得到PMB/GCE;将NDM-1与戊二醛(GA)混合滴加到PMB/GCE上制备得到NDM-1/PMB/GCE工作电极。经过实验条件优化,以Pen G和AMP为抗生素模型,利用DPV方法进行检测。结果表明在Pen G浓度为1.0×10~(-5)-1.0×10~(-2)μg·mL~(-1)时,NDM-1/PMB/GCE传感器的响应电流与Pen G浓度呈线性关系,线性方程为y=326.98x+5.840(r~2=0.9934);当Pen G浓度为1.0×10~(-1)-1.0×10~1μg·mL~(-1)时,响应电流与Pen G浓度也呈线性关系,线性方程为y=0.3304x+9.9346(r~2=0.9927),经计算检测限为0.174 ppb。NDM-1/PMB/GCE传感器的响应电流与AMP浓度也呈线性关系,当AMP浓度为1.0×10~(-5)-1.0×10~(-2)μg·mL~(-1)时,线性方程为y=322.07x+22.82(r~2=0.9920);AMP浓度为1.0×10~(-2)-1.0×10~1μg·mL~(-1)时,线性方程为y=0.3420x+26.28(r~2=0.9916),检测限为0.35 ppb。并采用加标法成功实现了牛奶样品的检测。研究结果表明羧基功能化的金属基介孔碳材料COOH-Co@C和COOH-CoS_2@C可作为载体固定Pen X。所制备的Pen X生物传感器和NDM-1生物传感器灵敏度高、检测限低,能成功实现对牛奶样品的检测。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.7;TP212.3
【图文】：

中起关键作用，NDM-1 不仅可催化多种 β-内酰胺的水，MBLs 成员具有一个高度保守的 MBL 折叠，其特征为四层 β 三明治。另一个独特结构特征是具有一个或两个活性位点结合，这是催化反应所必需的。NDM-1 的活sn233 疏水残基组成，是与抗生素底物进行极性相互作用的催化水解抗生素的机制主要是，底物通过 β-内酰胺环1 的侧链相互作用而结合；β-内酰胺环上的羧基与 Zn2 和然后由 Zn1 和 Zn2 稳定的氢氧根离子攻击 β-内酰胺环键裂解[78, 79]，在打开 β-内酰胺环时，产生阴离子中间n1 相互作用，来自稠合环的酰胺氮和羧酸盐与 Zn2 相中间体质子化（如图 1.2）。

图 1.2 NDM-1 与 β-内酰胺底物结合（青霉素）的作用示意图Figure 1.2 Schematic diagram of the action of NDM-1 binding to β-lactam substrate(penicillin)1.4.2 青霉素酶青霉素酶属于 A 类 β-内酰胺酶，是一种丝氨酸水解酶，组成青霉素酶的氨基酸主要有丝氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等，其水解抗生素的原理是利用活性位点丝氨酸催化 β-内酰胺类抗生素（如图 1.3）[5]。目前常见的青霉素酶是从蜡状芽孢杆菌中提取纯化的，来源于这种 G+的青霉素酶对β-内酰胺类抗生素中的青霉素类抗生素有非常强的水解作用，常见的比如青霉素、氨苄青霉素、磺节西林，而对阿莫西林、吠节西林仅具有轻微的水解作用。其催化机制主要分为四个步骤：一是底物和酶结合后，酶的丝氨酸活性位点进攻底物 β-内酰胺环上的羰基，形成四面体酰化物中间体；二是 β-内酰胺环上的氮原子质子化伴随着 C-N 键断裂，形成酶-抗生素中间体；三是活性水分子进

霉素酶素酶属于 A 类 β-内酰胺酶，是一种丝氨酸水解酶，组成青霉素酶有丝氨酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等，其水理是利用活性位点丝氨酸催化 β-内酰胺类抗生素（如图 1.3）[5]。霉素酶是从蜡状芽孢杆菌中提取纯化的，来源于这种 G+的青霉素类抗生素中的青霉素类抗生素有非常强的水解作用，常见的比如青霉素、磺节西林，而对阿莫西林、吠节西林仅具有轻微的水解化机制主要分为四个步骤：一是底物和酶结合后，酶的丝氨酸活性 β-内酰胺环上的羰基，形成四面体酰化物中间体；二是 β-内酰胺质子化伴随着 C-N 键断裂，形成酶-抗生素中间体；三是活性水分重新形成四面体中间体；四是 β-内酰胺环上的羰基与丝氨酸间的共放出有催化水解活性的 β-内酰胺酶（如图 1.4）。

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本文编号：2805582