鱼鳔类肝素的提取分离、结构表征及活性评价

发布时间：2020-09-02 15:23

　　 鱼鳔作为水产品加工副产物之一,富含胶原蛋白、多肽和黏多糖等活性物质,是药食两用的滋补珍品,中医认为其具有补肾益精、散瘀消肿等功效,但其作用效果和功效因子不明。本课题以鱼鳔为原料提取类肝素化合物,并对其进行分离纯化、结构鉴定以及体外抗凝血和抗炎活性评价,以期为进一步阐明鱼鳔糖胺聚糖的结构组成和构效关系提供参考,为鱼鳔功效因子的开发与利用奠定基础。主要研究内容及结果如下:(1)建立并优化鱼鳔类肝素的提取工艺:采用酶法提取类肝素,并在单因素试验基础上,以加酶量、酶解时间和温度为影响因子,以类肝素得率为响应值,采用响应曲面法进行优化。结果表明,最佳提取条件为:2709碱性蛋白酶添加量5.4 mg/mL,酶解温度50℃,时间20 h,在该条件下类肝素得率为(1.79±0.05)%,与预测值相差3.24%。(2)鱼鳔类肝素的分离纯化与理化性质分析:采用大孔阴离子交换树脂吸附、氯化钠溶液梯度洗脱和乙醇沉淀进行分离纯化,并以氯化钠浓度、pH、温度为影响因子,吸附率为响应值,采用响应曲面法优化静态吸附工艺。结果表明,最佳吸附条件为:氯化钠浓度6.0 mg/mL,pH 8.0,温度45℃;梯度洗脱分离出四个组分,F1、F2、F3和F4,其中F4的得率最高,为(2.22±0.02)%。理化性质分析结果显示从F1到F4,类肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基含量逐渐升高,蛋白质含量递减;醋酸纤维素薄膜电泳结果显示,F1为单一条带,迁移率最低;F2和F3有四个条带;F4为单一条带,迁移率最大。选取得率最高且理化性质与肝素最接近的组分F4进行结构鉴定。(3)鱼鳔类肝素的结构鉴定:通过紫外光谱、高效凝胶色谱、柱前衍生-高效液相色谱、傅里叶红外光谱、酶裂解-质谱/质谱和核磁共振鉴定F4一级结构。结果表明:F4类肝素含量为(85.79±0.63)%;重均分子质量约为115844±1401 u;单糖组成为葡萄糖醛酸、N-乙酰基半乳糖胺和少量的艾杜糖醛酸、半乳糖;且具有羧基、乙酰氨基、硫酸基轴向伸缩等特征吸收峰。最终确定鱼鳔类肝素主要组成是由重复的二糖单位[→4GlcUAβ1→3Gal NAc(4S)β1→]构成的硫酸软骨素A。(4)不同分子量鱼鳔类肝素抗凝血与抗炎活性评价:为探讨分子量对其抗凝血和抗炎活性的影响,首先采用透明质酸酶对F4进行降解得到两个低分子量类肝素组分:DP1和DP2,其重均分子量分别为6089±33 u和4963±37 u;再通过测定活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和血浆凝血酶时间评价不同分子量的鱼鳔类肝素体外抗凝血活性;采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型评价其体外抗炎活性。结果表明,与肝素钠相比,鱼鳔类肝素的抗凝血作用较缓和,且分子量越低抗凝血活性越弱;各组分均能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中NO的过量分泌和ROS水平升高并存在剂量依赖性,且分子量越低效果越显著。进一步分析表明,低分子量的鱼鳔类肝素是通过抑制炎症细胞分泌NO、ROS、IL-6、IL-1β和IL-10等炎症介质来缓解LPS诱导RAW264.7细胞发生的炎症反应。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS254.9
【部分图文】：

广东海洋大学硕士学位论文rosoft Excel 2003 和 Origin 8.5 软件作图。分析类的筛选生物体内一般以糖蛋白的形式存在，酶解可以将鱼鳔中的分子多肽和氨基酸，使类肝素从糖蛋白中释放出来。糖醛，其含量可以反映类肝素的含量；蛋白质是鱼鳔主要成分杂质之一。因此，糖醛酸和类肝素得率越高、蛋白质得率 种鱼鳔的糖醛酸、类肝素和蛋白质的得率见图 2-1，可以物的糖醛酸和类肝素得率明显比其它 3 种鱼鳔高；而蛋白另外，类肝素化合物应是白色固体，本试验所制备的鳙鱼他鱼鳔的提取物呈不同程度的暗黄色。故本研究后续实验肝素。

图 2-2 蛋白酶种类对鱼鳔类肝素得率的影响fect of protease species on the extraction yield of hepariniods from试验结果对鱼鳔类肝素得率的影响图 2-3 氯化钠浓度对鱼鳔类肝素得率的影响

10图 2-3 氯化钠浓度对鱼鳔类肝素得率的影响fect of sodium chloride concentration on the extraction yield of heswim bladder工业生产中，常在酶解液中添加氯化钠。但各文献报道的差异。因此，有必要探究酶解时氯化钠的添加量。如图 提高鱼鳔类肝素的得率。这可能是低浓度的中性盐可以提提高酶解效率，促进多糖从糖蛋白中分离。另外，类肝素较高，钠离子可以与带负电荷的类肝素结合，促进更多类量分别为 0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 时，所得类肝素得率显著（P<0.05）。因此，本研究选取氯化钠的添加量为对鱼鳔类肝素得率的影响

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本文编号：2810772