纤毛型鼠李糖乳杆菌快速定量检测技术研究

发布时间：2020-09-02 19:32

　　鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是一种重要的益生菌,具有保持肠道微生态平衡,抑制有害细菌生长,消除过敏等生理功能,是目前被应用最为广泛的乳酸菌之一。目前含有鼠李糖乳杆菌的制品种类繁多,但由于设备条件和技术水平千差万别,导致产品质量参差不齐,许多产品存在活菌数不达标、种属标识不符等质量问题。因此建立快速、灵敏、精确的鼠李糖乳杆菌定量检测方法对评价益生菌产品质量、筛选理想菌株均具有重要意义。本论文围绕鼠李糖乳杆菌的快速定量检测,开展了以下几方面的工作。(1)通过LGG菌毛亚基SpaA制备抗体偶联免疫磁珠,通过辣根过氧化物酶放大信号,建立了一种免疫磁珠电化学传感器检测鼠李糖乳杆菌的方法。结果表明,在优化的最佳抗体浓度、磁珠用量、免疫时间和温度下建立了标准工作曲线,线性范围为2.56×103-2.56×107CFU/mL,最低检测限为22CFU/mL。该方法与干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌及嗜热链球菌均无交叉反应,说明该传感器具有良好的特异性。重复性实验结果表明:5个样本相对标准偏差(RSD)均小于5%重复性较好;稳定性实验结果表明,7 d后检测发现电流值相对于初始值下降了 2.07%,14 d和21 d后分别下降了 5.07%和9.91%,整个检测过程中表现出了良好的稳定性。牛奶模拟样品实验中回收率在91.74%-108.67%,RSD在2.72%-5.16%之间,表明该传感器能准确有效的检测鼠李糖乳杆菌,且整个检测过程不超过3 h。(2)以柠檬酸为碳源,乙二胺为表面钝化剂利用微波法合成了蓝色荧光的碳量子点,研究了其表面形态及荧光性质。通过共价交联的方法将合成的碳量子点标记SpaA抗体,特异性结合鼠李糖乳杆菌后通过荧光分光光度计测定其荧光强度来进行定量检测。结果显示,合成的碳量子点尺寸均一、分散性好,最佳激发波长为350nm,荧光强度不受K+,Na+的影响,在pH4-11之间荧光强度相对稳定,适合用于微生物检测。在优化最佳检测条件下建立了标准工作曲线,线性范围为5×104-5×108CFU/mL,最低检测限为103CFU/mL。同时也考虑了该方法的特异性并与菌落免疫印迹及流式细胞术检测进行对比。结果表明,该方法与鼠李糖乳杆菌Bm01、LYO、BG均无交叉反应,鼠李糖乳杆菌LV108和CRL1505有一定的阳性信号但显著低于LGG的荧光强度,与落免疫印迹实验结果基本一致,表明了该方法具有良好的特异性。流式细胞术实验中将碳量子点(CDs)与传统染料(异硫氰酸荧光素)FITC进行对比,结果基本一致,但CDs具有耐光漂白、低细胞毒性、良好的生物相容性且成本低廉、操作简便等特性,为微生物检测提供了一种新颖绿色的工具。(3)为筛选廉价的鼠李糖乳杆菌特异性识别元件,以鼠李糖乳杆菌LGG为宿主菌,从粪便样品中分离得到鼠李糖乳杆菌噬菌体,命名为LRPYZU021。透射电镜观察发现,LRPYZU021噬菌体形态为长尾噬菌体科,裂解谱试验显示噬菌体LRPYZU021只能裂解其宿主菌LGG,无法裂解其他5种鼠李糖乳杆菌,体现了该噬菌体极好的特异性。研究了噬菌体的基础生物学特性。结果表明,噬菌体LRPYZU021在pH 6.0-11.0下稳定性较好;在50℃及以下的温度条件下,耐受性较好,对噬菌体进行最佳感染复数、一步生长曲线、抑菌能力的测定,为进一步利用鼠李糖乳杆菌噬菌体作为检测特异性元件提供了新型材料。(4)将碳量子点标记鼠李糖乳杆菌噬菌体LRPYZU021,研究其标记效率以及标记好的噬菌体在存储过程中的活性和荧光强度的变化。结果表明,碳量子点标记噬菌体后噬菌体存活率为82.42±4.72%,108PFU/mL浓度的噬菌体标记后有较强的荧光,体现了该方法良好的标记效率。储存过程中噬菌体活性在5d内无显著降低,荧光强度在储存过程中保持稳定。将标记后的噬菌体特异性的吸附鼠李糖乳杆菌后通过荧光分光光度计测定其荧光强度以此来检测鼠李糖乳杆菌,同时也考虑了该方法的特异性,并与流式细胞术检测进行对比。结果表明,当细菌浓度为107CFU/mL以下时荧光强度不明显,这可能由于CDs结合噬菌体效率低以及噬菌体诱导细胞裂解可能会阻碍量子点和噬菌体之间的相互作用;特异性表明该方法与Bm01、LYO、BG、LV108和CRL1505均无交叉反应,表明了该噬菌体相较抗体具有更好的特异性,为微生物检测提供了一种新颖绿色,特异性极好的方法。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS207.3
【部分图文】：

硫化锌,肌肉注射,淋巴管,小鼠

Ｓｉｍ等ｔ６５］首次将通过？￡０１５0＿纯化的碳点引入细胞成像系统，应用于大肠杆菌共聚焦成像。逡逑Ｃａｏ等网用ＰＰＥＩ－ＥＩ修饰碳点使其具有双光子荧光特性，并成功观察到碳量子点进入ＭＣＦ－逡逑７细胞（图１－１）内部，说明碳量子点优秀的细胞成像功能。逡逑ＩＨＩＭｉ逡逑图Ｍ碳量子点用于ＭＣＦ－７细胞成像图［８０］逡逑Ｆｉｇｌ－１邋Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ邋ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＭＣＦ－７邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ邋Ｃ－Ｄｏｔｓ逡逑除了细胞成像外，ＣＤｓ由于其本身无毒的性质也被大量的用于活体研宄来示踪传输循逡逑环机理。Ｙａｎｇ等Ｍ将ＰＥＧ纯化的碳量子点和掺杂硫化锌的碳量子点注入小鼠体内，如图逡逑１－２实验者将制备的碳点皮内注入到老鼠体内，随着时间的推移ＣＤｓ慢慢迁移至腋下淋巴逡逑结，然后将组织切片检测到了其在体内的荧光。逡逑Ｈ邋■醒逡逑图１－２小鼠腋下肌肉注射掺杂硫化锌碳点后在淋巴管中徖移图［８１］逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＺｎＳ－Ｄｏｔｓ邋ｉｍａｇｅｓ逡逑

碳纳米粒子,荧光,猝灭,交联

信号进行实时的监控和跟踪药物。Ｋｉｍ等用ＣＤｓ与金纳米粒子表面的ＰＥＩ与ｐＤＮＡ交逡逑联，交联后碳点的荧光被ｐＤＮＡ猝灭。然后将交联体导入细胞，在紫外光照射Ｆ释放ｐＤＮＡ，逡逑碳点的荧光恢复，通过监测释放后的ｐＤＮＡ，达到药物传输的目的（图１－３）。碳量子点不逡逑仪是出色的药物载体，同时也是能量供体，此外不需要额外的荧光标记物，生物相容性好，逡逑能有效的将药物运送到癌细胞中。逡逑ＣＤ－ＰＥＩ逦ｆ逦＾邋Ａ？ｔｏｃｉａｌ？ｏｎ邋＾逦＼邋＼逡逑＋邋＾ｅ＝２ｃ＾（邋－ＶＶ））逡逑－５逦ｃＤ＝ｅ＝ｒＮＡＸ＼逡逑Ａｕ－ＰＥｌ逦－逦Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ逡逑Ｃｅｌｌ逦＆邋＊邋＊邋＊邋＾．邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ逡逑４６５邋ｎｍ邋Ｒｅｃｏｖｅｒｙ邋0ｆ邋ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ逡逑图ｌ－３ＣＤ－ＰＥＩ／Ａｕ－ＰＥＩ／ｐＤＮＡ组装体用于基因传送和细胞运输实时监测丨８３】逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋ＣＤ－ＰＥＩ／Ａｕ－ＰＥＩ／ｐＤＮＡ邋ａｓｓｅｍｂｌｙ邋ｆｏｒ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ逡逑１．４．２．３分析检测逡逑碳量子点的荧光性质受表面官能团的影响，能和多种金属离子及分子相互作用。碳纳逡逑米粒子探针的构建主要依靠其荧光猝灭或增强来实现，而电子转移、动态碰撞及复合物或逡逑络合物的形成都可能导致碳纳米粒子的荧光发生猝灭或增强＠１。荧光碳纳米粒子用于检测逡逑金属离子和小分子的优点是用量少、反应灵敏、结果可靠、检出限低、线性范围宽

曲线,磁珠,荧光,图片

２．３．２免疫磁珠的表征逡逑２．３．２．１焚光表征逡逑如图２－２所示，图Ａ为偶联ＳｐａＡ多抗磁珠，通过荧光显微镜观察，蓝色激发光下产逡逑生绿色荧光。图Ｂ为对照组不产生绿色荧光。结果表明ＳｐａＡ多抗成功功能化于磁珠表面。逡逑ｍｍ逡逑图２－２磁珠的荧光图片逡逑Ｆｉｇ２－２邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＭＢｓ逡逑Ａ：邋ＭＢｓ－Ａｂ－ＳｐａＡ；邋Ｂ：邋ＭＢｓ逡逑２．３．２．２红外表征逡逑如图２－３所示，曲线ａ中，５８４邋ｃｍ－１处对应有吸收峰，是Ｆｅ－０键的特征峰。曲线ａ中逡逑１７００－１５７５邋ｃｍ－１、１４６０－１４２０邋ｃｍ－１有两个特征峰，分别对应为Ｃ＝０、－０Ｈ的特征吸收峰，证逡逑明该磁珠为羧基化磁珠。曲线ｂ中，１６９０－１６３０ＣＨＴ１处对应有酰胺键的吸收峰存在，红外光逡逑谱结果表明抗体成功偶联于磁珠表面［９４］。逡逑

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