原子力显微镜在食源性蛋白质纳米纤维结构分析中的应用研究

发布时间：2020-09-02 19:09

　　食品蛋白是无毒、营养丰富、易消化、易获取和农业可持续的人体营养摄入的关键蛋白质,每天由饮食摄取的食物蛋白质对人体健康有着十分重要的作用,常见的食物蛋白主要有四种来源:(1)动物来源(2)植物来源(3)大型藻类来源(4)微生物来源。食品蛋白质的结构在食品加工(即热加工和非热加工)或储存过程(即低温保存)中可能发生变化,这对蛋白在体内的生物利用率、代谢和营养能力等都有一定的影响。因此,研究食品蛋白的结构特征及其在不同原料制备、加工或保存过程中的变化对更好利用食品蛋白是十分必要的。原子力显微镜作为一种重要的纳米技术工具在食品蛋白研究中有着广泛的应用,其中高度成像是研究食品蛋白最常用的方法。本课题以食源性蛋白中的胶原蛋白、玉米醇溶蛋白为主要研究对象,运用原子力显微镜从纳米尺度到微米尺度对其进行了相关研究,具体开展了如下工作:(1)采用醋酸法、热水法和氢氧化钠法三种提取方式从罗非鱼皮中提取胶原蛋白,基于湿鱼皮的质量,三种提取方式胶原蛋白产量为:醋酸法(11.7%)热水法(10.7%)氢氧化钠法(8.5%),基于鱼皮中初始胶原蛋白含量21.89g/100g蛋白产率分别为:醋酸法(53.4%)、热水法(48.9%)、氢氧化钠法(38.8%)。运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对三种提取方式胶原进行分子量的测定得:三种提取方式胶原蛋白分子量不同,且氢氧化钠法提取的胶原分子大多是水解的;衰减全反射-傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)结果显示三种提取方式的胶原蛋白具有相似的分子结构。(2)对醋酸法提取的罗非鱼皮胶原蛋白(TSC)、I型牛肌腱(BFTC)和小鼠尾胶原蛋白(RTC)进行多态性和稳定性的研究,运用SDS-PAGE电泳对同一浓度不同上样量和不同浓度同一上样量的三种胶原研究得出:浓度相同不同上样量的三种胶原蛋白条带强度有明显差异,而对是否能够跑出蛋白条带无明显影响;浓度不同上样量相同时,蛋白浓度的大小对是否能够跑出蛋白条带有显著影响。运用ATR-FTIR光谱对不同热处理时间(0、7、14、21、28d)后波段范围在1600-1700cm~(-1)三种胶原蛋白二级结构分析得BFTC二级结构随时间变化不明显,而RTC和TSC两种胶原则随时间变化明显。运用原子力显微镜(AFM)对不同浓度下三种胶原蛋白的多态性进行观察,得纳米结构的形成具有一定的浓度依赖性。将浓度为0.4mg/mL的三种胶原蛋白液,在37℃条件下恒温孵育不同时间(0、7、14、21和28d)对蛋白结构稳定性进行研究得:BFTC在孵育过程中纳米纤维转化为左旋螺纳米纤维,然后再转化为纳米颗粒;RTC纳米结构由原纤维、纳米颗粒和无序聚集物转化为纳米颗粒和原纤维;TSC纳米结构的纳米丝、纳米颗粒和无序聚集物结构则转化为纳米颗粒和原丝。(3)采用玉米醇溶蛋白进行蛋白带状膜/纤维膜的制备,运用普通光学显微镜进行成膜浓度的确定得,浓度为35%时能够制备得到大量长纳米带,且几乎没有纳米微粒的存在。因此,可用于纳米带/纤维膜的制备。运用扫描电镜(SEM)确定带状/纤维膜的成功制备,并用AFM对制备的膜进行截面分析,进一步确定蛋白膜的形状。然后,将制备得到的带状/纤维膜用于Fe~(3+)的检测实验,发现载姜黄素玉米醇溶蛋白带状膜能够更迅速,更高效的用于Fe~(3+)检测实验,且可用于饮用水中Fe~(3+)含量的检测,检测温度对Fe~(3+)的快速检测有明显影响,制备的这些纳米带状膜具有良好的储存稳定性。从而为蛋白带状膜的制备和其在实际生产当中的应用提供了指导,相信这也将在材料、环境和食品科学等科学和工程领域引起越来越多的关注。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.21
【部分图文】：

序列,胶原酶,胶原纤维,原位

图 1-1 胶原酶降解胶原纤维的高速 AFM 原位成像(a)该过程的高度图像序列。标记 C 和 N的实线表示胶原纤维的极性。带有线条的绿色圆圈代表胶原蛋白上的单个胶原酶分子。时间表示添加胶原酶后经过的时间。Bar 为 50 nm; (b) (a)中突出区域的波动曲线记录仪，（c）对应于（a，b）中标记的纤维数量相对应的单个最小纤维厚度的时间进程，虚线框的（蓝色）或（绿色）对应与（a）中单个纤维上的胶原酶累积运行长度；（d）连续的高速 AFM 原位高度图像，显示了在胶原酶分子(圆形)作用下，最小原纤维(箭头)的消失。Bar 为 20nm；扫描速率均为 0.3秒/帧；所有的 z-标度都是 5nm。经引用许可转载自参考文献（Watanabe Nakayama 等人，2016）Fig 1-1 In situ high speedAFM imaging of minimal collagen fibril degradation by collagenase.(a) Height image sequence of this process. The solid line with labels of C and N indicated collagenfibril polarity. Green circles with lines represent individual Collagenase molecules on collagen. Thetimes indicated the elapsed times after the addition of collagenase. Bar was 50 nm; (b) Kymographfor the region highlighted in (a). (c) Time courses of thicknesses of individual minimal fibrilscorresponding to the number-labed fibrils in (a,b), with accumulated collagenase run length onindividual fibrils within (blue) or including the outside (green) of the dashed-line box in (a). (d)Successive in situ high speedAFM height images of disappearance of a minimal fibril (arrowhead)

麦醇溶蛋白,蛋糕,聚集体,中谷

图 1-3AFM 对蛋糕中麦醇溶蛋白和谷蛋白的观察；（a）麦醇溶蛋白聚集体的 AFM 图像；（b）麦醇溶蛋白聚集体的大小分布，在每个尺寸范围内，字母不同的组有显著差异（P<0.05）；(c)传统蛋糕和无蛋蛋糕中谷蛋白的多孔结构（d）SPI + 0.1％XN（e）SPI + 1％MDG（f）SPI +1％SL（g）SPI + 0.1％XN + 1％MDG（h）SPI + 0.1％XN + 1％SL；SPI-大豆分离蛋白；XN-黄原胶；MDG-单甘油酯；SL-大豆卵磷脂。经引用许可转载（Lin,et al.2017b）（版权所有 2017爱思唯尔出版社）Fig 1.3 AFM observation of gliadin and glutenin in cakes. (a) AFM image of gliadin aggregates;(b) Size distribution of gliadin aggregates. Within each size range, groups with different letters aresignificantly different (P < 0.05). Porous structures of glutenin in (c) traditional cake and egglesscakes with (d) SPI + 0.1% XN, (e) SPI + 1% MDG, (f) SPI + 1% SL, (g) SPI + 0.1% XN + 1% MDG,(h) SPI + 0.1% XN + 1% SL. SPI soy protein isolate; XN xanthan gum; MDG mono,diglycerides; SL soy lecithin. Reprinted with permission of reference. (Copyright 2017 ElsevierPublisher)AFM 结果表明，蛋糕配方主要包含了麸朊聚集体，其直径范围在 100-200nm，

高度图,乳清,相位成像,蛋白膜

图 1-4 纯乳清分离蛋白膜(A, B)和乳清分离蛋白-玉米醇溶蛋白纳米颗粒膜的 AFM 相位成像。经引用许可转载（版权所有 2016 爱思唯尔出版社）Fig 1-4AFM phase images of pure WPI film (A, B) and WPI-zein nanoparticle film (C, D).Adapted with permission of reference. (Copyright 2016 Elsevier Publisher)1.6.4 食品蛋白加工及保存效果研究了解不同加工和保存条件对食品蛋白的影响，对于开发食品加工和保存的新技术、新方法具有重要意义。AFM 可用于加热、冷冻干燥、高压等不同物理处理条件下食品蛋白质的观察。为验证乳糖糖基化乳清分离蛋白膜的分散性，图 5 是Liu 等人[28]在 pH3-7 条件下，运用 AFM 轻敲模式对加热前后乳糖糖化的乳清分离蛋白膜进行的研究，高度图像显示了其分散的纳米结构，在 pH4-6 条件下加热后的样品比 pH3 和 pH7 条件下的样品更粗、更大。该研究证明 AFM 纳米成像可用于分析复杂加工条件对食品蛋白质的影响。朱等运用 AFM 研究了大豆分离蛋白（SPI）和乳清蛋白的热诱导聚集，结果表明热可以诱导纳米粒子的形成，此外，热诱导的大豆分离蛋白纳米颗粒的粒径比乳清蛋白大。运用 AFM 观察大豆分离蛋白（SPI）在液氮冷冻和冷冻干燥后的变化，发现大豆分离蛋白膜表面光滑，空腔

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