乳酸菌发酵豆奶的蛋白结构表征及其致敏性的细胞学评估

发布时间：2020-10-10 07:23

　　 豆奶是一种营养价值很高的健康饮品,富含优质蛋白质、铁元素、不饱和脂肪酸、维生素、膳食纤维和异黄酮,且价格便宜,适合世界大多数人群饮用,尤其是乳糖不耐受人群和对牛奶过敏的人群。但是,大豆属于八大过敏原之一,这限制了豆奶的消费范围。目前,乳酸菌发酵已被用于制备发酵型豆奶,研究表明,微生物发酵会影响大豆蛋白的致敏性。因此,探究发酵对豆奶蛋白致敏性的影响具有积极的社会价值。本论文采用短乳杆菌和乳杆菌属混合液态发酵豆奶,分析发酵对豆奶蛋白结构和致敏性的影响。研究内容包括:发酵豆奶蛋白的结构、表位及功能性质分析;利用体外模拟胃肠道消化发酵豆奶,探讨发酵对豆奶消化稳定性的影响,并评估发酵豆奶消化产物的IgG和IgE结合能力;以人嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒模型评估发酵豆奶蛋白及其胃肠道消化产物的致敏性。本论文的主要方法、结果及结论如下:1、按照最优发酵条件制备发酵豆奶:4%接种量,接种比例为短乳杆菌:乳杆菌属3:2,温度为33℃,发酵时间为24 h。提取发酵豆奶中蛋白,利用圆二色谱、紫外光谱、ANS荧光探针法和Ellman分光光度法表征其结构;采用LC-MS鉴定发酵产物的小分子肽段,并通过免疫印迹分析发酵对豆奶蛋白与IgG结合能力的影响;同时,测定发酵豆奶蛋白的水解度、乳化性和起泡性。结果表明:与未加工的豆奶蛋白相比,发酵使豆奶蛋白的空间结构变得更加松散,破坏了大豆球蛋白G2亚基K57-P111、S219-N233、E169-S215、S249-Q271和β-伴大豆球蛋白α亚基N232-M383等五个人IgE结合表位,并使豆奶蛋白与IgG结合能力显著降低;发酵豆奶蛋白水解度为20.96%,乳化性、乳化稳定性和泡沫稳定性明显降低,起泡性明显升高。2、体外模拟胃肠道消化发酵豆奶,利用Tricine-SDS-PAGE、RP-HPLC和水解度分析发酵对豆奶蛋白消化稳定性的影响,利用竞争抑制ELISA分析消化产物的IgG和IgE结合能力。结果表明:发酵能显著改善β-大豆球蛋白和大豆球蛋白的消化性;同时,与豆奶消化产物相比,发酵豆奶的消化产物与IgG和IgE结合能力显著降低,说明发酵能降低豆奶蛋白的抗原性和潜在致敏性。3、建立人嗜碱性粒细胞KU812细胞致敏模型,通过检测细胞脱颗粒释放的炎症介质和细胞因子评估发酵豆奶及胃肠道消化产物的致敏性。结果表明:发酵豆奶蛋白激发KU812细胞产生β-HEX、IL-4水平及胞内钙离子浓度均显著低于豆奶组,组胺和TFN-α水平也有降低的趋势,但IL-6水平显著升高;对于胃消化产物,发酵豆奶组细胞产生β-HEX、组胺、IL-6、TFN-α、IL-4水平及胞内钙离子浓度均显著低于豆奶组;对于胃肠消化产物,除组胺外,发酵豆奶组细胞产生的β-HEX、IL-6、TFN-α水平显著降低,IL-4水平和胞内钙离子浓度也有降低的趋势。综上所述,发酵具有降低豆奶蛋白致敏性的潜力。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS275.4
【部分图文】：

图 2.1 发酵豆奶蛋白远紫外圆二色谱图（A）及其二级结构组分含量（B）Fig.2.1 Far-UV CD spectrum (A) and secondary structure of fermented soymilk protein (B)2.4.2 发酵对豆奶蛋白紫外吸收光谱的影响蛋白质的紫外吸收主要归因于色氨酸和酪氨酸残基等生色基团，它可以反映出蛋白质三级结构的折叠及展开情况。如图 2.2 所示，与豆奶组蛋白相比，灭菌组豆奶蛋白在波长 260 nm 处的紫外吸收强度升高，说明豆奶蛋白经热加工处理后，蛋白质发生变性，使生色基团转移到蛋白质表面，从而使紫外吸收增强。经发酵之后，豆奶蛋白的紫外吸收强度进一步升高，原因可能是因为发酵之后，蛋白发生了水解，结构变得更加松散，生色基团进一步暴露。同时，圆二色谱表明发酵豆奶蛋白 α-螺旋下降，结果均表明发酵使豆奶蛋白的二级和三级结构发生了显著的变化。

发酵豆奶蛋白远紫外圆二色谱图（A）及其二级结构组分含量-UV CD spectrum (A) and secondary structure of fermented soymi豆奶蛋白紫外吸收光谱的影响紫外吸收主要归因于色氨酸和酪氨酸残基等生色基团结构的折叠及展开情况。如图 2.2 所示，与豆奶组蛋波长 260 nm 处的紫外吸收强度升高，说明豆奶蛋白生变性，使生色基团转移到蛋白质表面，从而使紫外奶蛋白的紫外吸收强度进一步升高，原因可能是因为，结构变得更加松散，生色基团进一步暴露。同时， α-螺旋下降，结果均表明发酵使豆奶蛋白的二级和三

发酵对豆奶蛋白结构、表位及功能性质的影响酵对豆奶蛋白表面疏水性的影响白的疏水性对于稳定分子内蛋白质的结构非常重要，与疏水性相关白表面分布的非极性脂质及芳香族氨基酸残基，可被用来监测蛋白。豆奶发酵前后蛋白的表面疏水性如图 2.3 所示。从图中可看到的表面疏水性显著升高，加热之后，豆奶蛋白发生聚集，结构变疏水性基团被暴露后与 ANS 结合，使荧光强度升高。

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本文编号：2834908