两种提高传统免疫学分析方法检测灵敏度的新型信号放大策略研究

发布时间：2020-10-14 20:10

　　 传统免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫层析法(Immunochromatographic assay,ICA)两大类。其中,ELISA采用辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)催化有机底物四甲基联苯胺(Tetramethyl benzidine,TMB)显色作为免疫分析的信号源,而ICA则采用30-40 nm球形胶体金纳米粒子(Gold nanoparticle,AuNP)为信号源。以上两大类方法因信号输出能力弱,导致检测方法灵敏度总体偏低,介于μg/mL-ng/mL之间,难以满足微量乃至痕量目标分析物检测的需求。提高上述两类免疫分析方法的检测灵敏度对于拓宽其应用范围具有重要的学术以及实际应用价值。基于此,本研究构建了两种改善传统免疫分析方法检测灵敏度的新型信号放大策略,具体内容如下:(1)提高信号分子的负载量构建高信号输出能力得探针是提高免疫分析方法检测灵敏度常用的策略之一。其中以纳米粒子为载体负载酶可以在单个纳米粒子上实现大量酶分子的固定化,因而可显著提高ELISA检测信号,实现待测物超灵敏检测。本研究拟以多枝状纳米金(Gold nanoflower,AuNFs)为载体,通过在其表面修饰双亲性配体,利用AuNFs表面疏水腔分别大量负载四苯基卟啉铁(FeTPPCl)及荧光素(Fluorescein)分子,以制备两种高效的纳米酶(AuNF@FeTPPCl和AuNF@Fluorescein)。利用FeTPPCl和Fluorescein的HRP模拟酶活性以及AuNFs的超强装载能力,在传统固相酶免疫学分析基础上,分别构建高灵敏检测食品中伏马毒素B_1(Fumonisin,FB_1)的直接竞争ELISA和血清中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)的双抗体夹心ELISA。同时,采用Fluorescein的荧光发射作为免疫学信号输出,进一步构建“比色-荧光”双模式ELISA新方法,大大提高传统单模式分析的准确性。为此,本研究首先合成了氨基/羧基末端的双亲性链“巯基-壬烷-四甘醇-氨基/羧基”并借助Au-S键的强配位作用将其修饰于90 nm AuNFs表面,形成疏水腔。随后通过疏水相互作用分别将FeTPPCl和Fluorescein负载于AuNFs的表面疏水腔中,形成AuNF@FeTPPCl和AuNF@Fluorescein纳米酶。酶载量分析显示,单个AuNF载体可分别负载2.4×10~6个FeTPPCl和3.67×10~6个Fluorescein;酶活性分析表明,FeTPPCl和Fluorescein的装载和释放对其HRP模拟酶活性没有明显影响,且该纳米酶对底物H_2O_2和TMB的单位转化数(Kcat)较传统HRP提高了1-2数量级,有助于提高传统ELISA的检测灵敏度。此外,该纳米酶还展现了更强的环境耐受性和长期保存稳定性,大大改善了方法学的重现性和稳定性。鉴于此,一方面以AuNF@FeTPPCl为载体偶联牛血清白蛋白(Bovine serum albumen,BSA)和FB_1作为竞争抗原以构建直接竞争ELISA实现FB_1定量检测,在最优条件下,其线性方程为y=-15.59ln(x)+123.84,R~2=0.9954,半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC_(50))为101 pg/mL,较常规ELISA低250倍,进一步将该方法应用于检测FB_1加标的大米、玉米和小麦样品,其回收率为87.9-110.8%,变异系数小于20%,表明该方法具有较好的准确度,可用于实际样本中FB_1的检测;另一方面以AuNF@Fluorescein为载体,结合生物素-链霉亲和素放大体系,建立了灵敏、准确检测甲胎蛋白(AFP)的“比色-荧光”双模式夹心ELISA,在最优条件下,采用比色检测模式,其线性方程为y=2.0785x+109.8,检测灵敏度为17.7 pg/mL,较常规ELISA高15倍,而采用荧光检测模式,其线性方程为y=1.2924x+0.1117,检测灵敏度低至29 fg/mL,较常规ELISA高9300倍,进一步将该方法应用于20个AFP加标血清样本的检测,并将其检测结果与商业化Abcam化学发光试剂盒进行对比,表明该方法两种检测模式下与试剂盒的检测结果均有较高的线性相关性(相关系数:比色为R~2=0.9856,荧光为R~2=0.9966),同时与血清中其他常见蛋白标志物无明显交叉反应,表明该“比色-荧光”双模式ELISA适用于实际血清样本中AFP的灵敏、准确检测。(2)提高AuNP探针的信号强度是改善免疫层析方法灵敏度的重要策略。金、银信号生长增强策略通过在AuNP表面还原沉积金、银纳米壳层,诱导AuNP粒径增大,因而可大大提高试纸条灵敏度。但该方法纳米壳层的还原沉积严格依赖时间变化的生长模式,有着严格的操作要求,重现性差,且常产生非特异性背景信号。针对以上问题,本研究建立了聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)为骨架,铜纳米粒子可控生长增强AuNP-ICA检测灵敏度新方法。在该模式下,AuNP探针通过PEI介导饱和吸附铜离子,随后通过抗坏血酸钠还原为单质铜沉积于AuNP探针表面,增大其粒径,显著增强AuNP显色信号强度。由于被吸附的铜离子量与检测线上捕获的AuNP探针数量呈现良好的剂量关系,因此该方法具有检测灵敏度高、重现性好的特点。在最适条件下,将铜纳米粒子可控生长的AuNP-ICA用于检测牛奶中的大肠杆菌O157:H7,其检测灵敏度为6CFU/mL,较放大前提高了三个数量级,且检测时间少于20分钟。进一步利用该方法对17种常见的食源性致病菌进行检测,未见明显交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。通过对15个随机加标的牛奶样进行检测,结果显示回收率介于84%-116%之间,变异系数均小于12%,表明该方法能够用于大肠杆菌O157:H7的现场快速超灵敏定量筛查。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS207.4
【部分图文】：

Figure 3. Schematic of the the catalase based fluorescence ELISA for OTA detection.图 3 基于过氧化氢酶荧光 ELISA 检测 OTA 原理图。1.2.4 适配新型信号输出体系尽管制备高信号强度的纳米探针提高免疫分析方法的检测灵敏度展现了大的应用前景，但是这些新兴的技术往往无法与市场现有的技术平台完全匹导致产业转化效率偏低。例如：针对 HRP/碱性磷酸脂酶的保护剂不适用于基纳米材料构建的传感器；纳米材料的稳定性依赖于其表面配体，无法冻干处等[72]。因此采用催化活性更高的酶取代 HRP 作为标记物，并适配信号输出能更强的底物作为信号源是提高传统免疫分析方法灵敏度的有效策略。如图 3示，Huang 等以过氧化氢酶作为标记物，以过氧化氢敏感的量子点作为信号通过在过氧化氢酶上标记抗原，建立直接竞争荧光 ELISA 超灵敏检测粮食OTA 的新方法[4]。除了上述的荧光 ELISA 外，表面等离子共振 ELISA 也是过采用新型的等离子信号输出体系提高免疫分析方法检测灵敏度。早在 2

第 1 章 引言响应型ELISA也是通过采用新型信号输出体系提高免疫分析技术检测灵敏度的策略之一[80]，其原理如图 4 所示。以葡萄糖氧化酶/脲酶等能够催化底物产酸或产碱的天然酶为标记物，采用溴甲酚紫等 pH 敏感的指示剂作为信号源建立 pH响应型 ELISA[81]。但是这类方法由于采用的 pH 指示剂过于敏感，且底物往往需要溶解在超纯水等缓冲能力弱的缓冲液中，因而在实际应用中操作难度较大，重现性低。

第 1 章 引言到 10-19M[91]。此外，由于金属优异的光学特性，因此金属生长法也被开发应用于信号增强，相较于上述增强策略，金属生长法不需要对免疫学探针进行额外的改造[92]。如图 5 所示，在试纸条上完成第一轮免疫学反应后，通过在试纸条检测区域二次涌动、滴加或者浸泡等方式添加金属生长液，在还原剂的作用下，金属离子被还原成单质并通过“负电位沉积效应”沉积在胶体金表面进而提高探针的信号强度[93]。目前常见的金属生长策略主要包括金和银两种贵金属的生长[94-99]。尽管金属生长法不需要设计和合成复杂的纳米材料或者开发高敏的信号输出体系，但是该类方法需要后期添加增强液，这无形延长了检测时间，因此不适用于对检测时间要求严格的目标物分析。此外，相对于传统信号输出模式，信号放大策略在常规免疫分析技术流程之外需要额外增加信号放大流程，因此有着更大的系统误差。
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本文编号：2841131