氨基功能化磁性纳米粒子富集结合多重PCR检测食源性致病菌

发布时间：2020-10-14 21:37

　　 食品生产过程中可能受到多重病原菌的污染,对消费者的健康造成严重威胁,快速检测食品中的致病菌,对保障食品安全十分重要。然而食品中污染的病原菌通常数量较少,且食品成分中存在干扰性物质,影响检测方法的灵敏度及特异性,因此,对食品中致病菌进行分离或富集是十分重要的。磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)具有良好的生物相容性,而且容易分离,在食源性致病菌的分离和检测方面受到青睐。本研究制备一种带正电荷的氨基功能化磁性纳米粒子(Amino functionalized magnetic nanoparticles,AF-MNPs),与负电荷的细菌间静电相互作用,对细菌进行富集,结合多重PCR法检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。具体研究内容和结果总结如下。1)AF-MNPs的制备及表征。通过化学共沉淀法制备Fe_3O_4 MNPs,表面修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),合成了表面携带正电荷的AF-MNPs,并进行表征。结果表明制备的AF-MNPs呈球形或类球形,粒径约为10 nm,电镜下一定程度上有团聚现象,纳米粒度分析仪测定分散型指数(Polydispersity inde,PdI)为0.10±0.036,分散性良好,等电点在9.4左右,在pH 2-9其表面带正电荷。2)AF-MNPs富集食源性致病菌。AF-MNPs对细菌的吸附捕获主要是基于带正电荷的MNPs和带负电荷的细菌之间的静电相互作用。以S.aureus、L.monocytogenes、S.enteritidis和大肠杆菌(Escherichia coli)为目标菌株,研究AF-MNPs与细菌之间相互作用的影响因素,包括AF-MNPs、细菌和缓冲体系。结果表明,以100μg AF-MNPs与浓度为10~3 CFU/mL的细菌在PBS中温育60 min,对S.aureus、E.coli、L.monocytogenes的捕获率均高于97%,但对S.enteritidis的捕获率低于40%;在pH 5-9 PBS(10 mmol/L)中,AF-MNPs对S.aureus和E.coli的捕获率均大于80%,在pH 4-8 PBS(10 mmol/L)时,AF-MNPs对L.monocytogenes的捕获率均大于75%;在PBS浓度为5-30 mmol/L范围内对S.aureus,L.monocytogenes,E.coli的捕获率分别保持在75%、85%以及90%以上;在研究的4种细菌中,S.enteritidis的Zeta电位值最小,捕获率最低;100μg的AF-MNPs对细菌浓度在10~2-10~6 CFU/mL的范围内捕获率菌高于85%;在体积为10 mL的缓冲溶液中,对浓度为4 CFU/mL、40 CFU/mL和400 CFU/mL的细菌捕获率超过90%。人工污染牛奶中,AF-MNPs对S.aureus,E.coli,L.monocytogenes和S.enteritidis的最高捕获效率为分别为67.14%±1.33%、62.89%±0.68%、57.92%±2.93%和30.26%±0.69%;在人工污染的西瓜样品中,AF-MNPs对于S.aureus、L.monocytogenes、E.coli和S.enteritidis的最高捕获率分别为85.38%±0.63%、69.84%±2.97%、79.28%±0.90%和31.66%±3.30%。为了检验AF-MNPs的适用性,采集8种咸菜样品和6种卤肉样品,AF-MNPs对咸菜食品中细菌的捕获率均高于75%,对卤肉样品的捕获率均高于65%。3)AF-MNPs富集结合多重PCR检测食源性致病菌。以AF-MNPs富集结合多重PCR检测人工污染牛奶中的S.aureus、L.monocytogenes和S.enteritidis。牛奶受到污染时,经AF-MNPs富集的人工污染牛奶样品中,S.aureus、S.enteritidis和L.monocytogenes的灵敏度分别为2 CFU/mL、2×10~2 CFU/mL和2 CFU/mL。而未经AF-MNPs分别捕获富集的人工污染牛奶样品中,S.aureus、S.enteritidis和L.monocytogenes的灵敏度分别为2×10~2 CFU/mL、2×10~3 CFU/mL和2×10~3CFU/mL。将三种食源性致病菌进行等浓度污染牛奶样品,经AF-MNPs富集结合多重PCR检测,对S.aureus、L.monocytogenes和S.enteritidis的灵敏度为20CFU/mL、2×10~2 CFU/mL和2×10~2 CFU/mL,较直接进行多重PCR,灵敏度分别提高100或1000倍,因此,AF-MNPs富集可以减少食品成分对检测方法的干扰,有效提高多重PCR检测的灵敏度。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TB383.1;TS207.4
【部分图文】：

氨基功能化磁性纳米粒子富集结合多重 PCR 检测食源性致病菌、核磁共振成像（Na et al 2009）、环境修复（Akbarzadeh et al 201离（姜源 等 2018）等领域（Ferreira et al 2016），氧化铁 MNPs 在被广泛应用于从复杂样品中快速、高效地磁分离富集细菌，作为细处理，如图 1.1（Dinali et al 2017）。氧化铁 MNPs 的广泛应用主要一些优异的特点（Li et al 2013）：易于制备（Fe3O4可以通过简单、模生产的水相共沉淀法来制备）；易于进行表面改性（氧化铁表面以方便地使用官能团进行改性修饰）；易于操作（由于具有超顺磁的作用下，无需经过离心或分离，即可从溶液中进行回收磁颗粒）性（磁性粒子通常可以重复利用）；良好的分散性。

氨基功能化磁性纳米粒子富集结合多重 PCR 检测食源性致病菌的影响较大（pH、离子强度和生物分子浓度），因此科学研究者更价偶联的方法对 MNPs 表面进行修饰。共价偶联是基于生物分子和价相互作用，通常有三种用于两者间的偶联方法：1）在纳米颗粒上然后在聚合物涂层和生物功能分子之间形成共价键，该方法的主要物质具有非特异性吸附因此，主要是通过以下两种方法来制备；2）粒表面偶联一层具有反应基团的分子，再与生物功能分子反应（表面反应的基团首先与生物功能分子结合，然后，共轭物与纳米颗路，如图 1.2。

物质具有非特异性吸附因此，主要是通过以下两种方法来制备；2）粒表面偶联一层具有反应基团的分子，再与生物功能分子反应（表面反应的基团首先与生物功能分子结合，然后，共轭物与纳米颗路，如图 1.2。图 1.2 将生物功能分子附着在纳米颗粒上的两种方法（Gu et al 2006）. 1.2 Two ways to attach biofunctional molecules to a nanoparticle（Gu et al 20的趋势是在同一 MNPs 表面上应用多种表面改性方法和/或几种表面 1.3。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 赵垠莹;;质谱法检测食源性致病菌技术研究进展[J];化工管理;2018年35期

2 毕红杰;张玉梅;任海鹏;王春东;卢俊荣;董晓枫;;2016-2017年河北省沧州市食品中食源性致病菌检测结果及分析[J];医学动物防制;2019年03期

3 郭海艳;;2017年海西州192份食品中食源性致病菌监测结果分析[J];青海医药杂志;2018年10期

4 王成;陆雨菲;刘箐;;光谱技术在食源性致病菌检测中的应用[J];光学仪器;2019年01期

5 武玉平;汪洋;杨爱青;徐一凡;张艳青;王淑田;;淄博市2013—2016年食源性致病菌监测结果分析[J];中国公共卫生管理;2019年04期

6 于明明;徐斌;张康;刘德辉;赵忠俊;王晓威;;2016-2017年潍坊市食源性致病菌监测结果分析[J];社区医学杂志;2019年12期

7 凌超;;食源性致病菌检测分析技术的研究进展[J];食品安全导刊;2019年26期

8 胡汝源;陈冉;杨红菊;;大理州地方特色食品食源性致病菌污染状况及相关危险因素分析[J];食品安全质量检测学报;2019年22期

9 李夸巧;张云娴;黄豆;彭丽超;;食品中食源性致病菌污染状况分析[J];食品安全导刊;2017年33期

10 ;“食源性致病菌”专题征稿函[J];食品安全质量检测学报;2017年12期

相关博士学位论文 前10条

1 王瑞;快速核酸扩增及可视化策略用于食源性致病菌和转基因作物检测[D];浙江大学;2019年

2 孙向华;北京生猪屠宰场猪肉产品食源性致病菌污染状况调查与研究[D];中国农业大学;2019年

3 孙嘉笛;基于纳米金增强效应新型生物传感方法构建及其在食源性致病菌毒力基因及miRNAs检测的应用[D];江南大学;2019年

4 李倩茹;基于荧光微球的食源性致病菌免疫检测方法的建立及评价[D];华南理工大学;2018年

5 张晓峰;基于肽核酸荧光原位杂交技术的食源性致病菌鉴定系统研究及其应用[D];浙江大学;2017年

6 邱驰;影响食品安全的食源性致病菌快速检测技术与风险分析研究[D];沈阳农业大学;2008年

7 卢行安;宫颈癌患者核糖核酸酶抑制因子基因突变分析和常见食源性致病菌快速检测技术体系的建立[D];大连医科大学;2007年

8 郭丹;两种重要食源性致病菌O血清型分子分型系统的建立、两株不同宿主来源的大肠杆菌比较基因组学和转录组学研究[D];南开大学;2013年

9 汪陈洁;乳酸对常见食源性致病菌的抗菌活性与作用机理[D];华中农业大学;2014年

10 王灵;快速特异检测大肠杆菌O157:H7的B细胞生物传感器研究[D];浙江大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 孙程;氨基功能化磁性纳米粒子富集结合多重PCR检测食源性致病菌[D];华中农业大学;2019年

2 钟俊良;速冻牛肉丸中大肠杆菌O157:H7活的不可培养状态形成机制的研究[D];武汉工程大学;2018年

3 贾甜甜;牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立[D];中央民族大学;2019年

4 刘宽;食源性致病菌多重荧光定量PCR检测体系的建立[D];浙江农林大学;2018年

5 谢同彬;量子点—纳米金复合探针检测食源性致病菌的方法研究[D];安徽农业大学;2018年

6 陈飞;郑州市售生鲜猪肉及待宰生猪主要食源性致病菌污染检测与分析[D];河南农业大学;2018年

7 龚少莹;橄榄多酚对食源性致病菌的抑菌作用及机理研究[D];东北农业大学;2018年

8 林佳琪;水产品中两种食源性致病菌的快速检测技术研究[D];集美大学;2016年

9 鄢雷娜;乳制品中三种食源性致病菌活菌快速检测方法的研究及检测试剂盒的应用[D];南昌大学;2018年

10 马丽娜;基于代谢产物的食源性致病菌快速检测技术研究[D];中南林业科技大学;2014年

本文编号：2841228