基于纳米抗体检测赭曲霉毒素A的荧光免疫分析方法的构建研究

发布时间：2020-10-17 17:59

　　 赭曲霉毒素A(Ochratoxin A.OTA)是最常见和毒性最强的霉菌毒素之一,是一种主要由曲霉菌和青霉菌等产毒菌株所产生的对人体或动物机体有毒害作用的次级代谢产物,有肾毒性、肝毒性和致癌性等多种毒性作用。针对真菌毒素,尤其是对OTA的检测过程一般较为耗时耗力,因而建立一种快速检测方法以实现对OTA的简便、快速和高效测定意义重大。荧光免疫分析简单、灵敏且重现性高的特点,使其对于检测一些霉菌毒素、微量元素和其他食品污染物有着至关重要的意义。纳米抗体(Nanobody,Nb)是已知具有完整抗原结合能力的最小功能单位,目前在许多领域中的应用均表现出优于传统抗体的特性。Nb具有较强的荧光性质,在均相体系中与OTA分子能发生有效的FRET反应,因此能够建立非标记型荧光免疫检测OTA的方法,本研究基于实验室前期开发的纳米抗体Nb28,以OTA和OTB为检测对象,利用Nb分子量小而荧光淬灭效率高的特点建立非标记型FRET检测体系。结果表明,对比传统方法该方法实现了检测速度快(10分钟)、灵敏度极大提升(0.06 ng/mL)、操作便利等优点,进而实现对OTA和OTB的超灵敏均相免疫检测,并进一步为食品安全领域的小分子化合物超灵敏荧光免疫检测方法的建立提供实验依据。量子点(Quantum Dots.QDs)具有光学性质稳定、易于表面修饰的特点,实验采用氨基水溶性量子点(GQD-NH2)偶联OTA作为能量供体,羧基水溶性量子点(RQD-COOH)标记Nb28纳米抗体作为能量受体,基于免疫学原理构建FRET均相竞争检测体系。根据偶联物的溶解性的不同,分别采用DCC/NHS和EDC/NHSS法制备不同投料比例的OTA-GQD和Nb-RQD偶联物,探讨了标记比例、供-受体反应比例及其他缓冲液条件对体系FRET效率的影响,并进一步探讨了谷物提取液的基质效应影响,将基于QDs的FRET均相竞争免疫检测体系成功应用于谷物中OTA的定量分析,该方法线性范围为5-1000pg/mL,检测限为5pg/mL。将Nb28基因通过基因工程技术酶切至绿色荧光蛋白(sfGFP)原核表达载体中,经过诱导表达及分离纯化后得到纳米抗体-绿色荧光蛋白融合蛋白(sfGFP-Nb28)。再将OTA偶联至氨基水溶性量子点(RQD-NH2),将sfGFP-Nb28作为FRET体系能量供体,OTA-RQD作为FRET体系能量受体,建立了基于纳米抗体-绿色荧光蛋白融合蛋白的FRET检测方法,并进一步消除了谷物提取液的基质效应影响,将该FRET方法成功应用于谷物中OTA的定量分析,检测限为5 pg/mL,线性范围为5-5000 pg/mL。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：O657.3;TB383.1;TS207.4
【部分图文】：

２．３．２．２Ｎｂ的间接竞争抑制曲线??在确定最佳抗体稀释倍数后，采用间接竞争ＥＬＩＳＡ法进一步测定Ｎｂ２８免疫??学反应能力，绘制ＯＴＡ竞争抑制曲线如图２－２，ＩＣ５〇值为０．８０?ｎｇ／ｍＬ。??１００?＿?Ｔ??．??８０?－?＇??＼??／－Ｓ?、??＾?．?＼??ｗ?羼??齋６０＿??ｂ?？?＼??＼??４０－?、＼??？?Ｋ??２０－?、、１??￣￣Ｉ￣Ｉ￣ｒ－ｒ－｜?Ｉ?！?｜?Ｉ―Ｉ￣Ｉｉ－Ｈ?１?１?！?１??０．１?１??Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＯＴＡ?（ｎｇ／ｍＬ）??图２－２．纳米抗体Ｎｂ２８对ＯＴＡ的竞争抑制曲线??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２．?Ｉｎｄｉｒｅｃｔ?ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ?ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?Ｎｂ２８?ｔｏｗａｒｄ?ＯＴＡ．??２．３．２．３?Ｎｂ的特异性分析??如图２－３，?ＯＴＢ和ＯＴＣ分别是ＯＴＡ的脱氯和乙基酯化衍生物，在结构上十??分相似，因此也有可能与Ｎｂ２８发生特异性结合。??ＯＴＡ??〇?〇Ｈ?Ｏ??＾?ＯＴＢ??ＯＨ３??ｃｈ２ｃｈ３??ａ°＇ｔ？ｕ?０?ＯＨ?〇??ＯＴＣ??ｔＨ３??Ｃｌ??图２－３．?〇ＴＡ、０丁Ｂ和ＯＴＣ的分子结构式??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３．?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＯＴＡ，?ＯＴＢ?ａｎｄ?ＯＴＣ．??１７??

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之间适当的空间距离（１０－１００人）；（２）供体的荧光发射光谱与受体的摩尔消光??光谱重叠程度较高；（３）供受体荧光光谱无明显交叉；（４）相对合适的偶极取向。??由图２－５可知，受体ＯＴＡ／ＯＴＢ的紫外吸收光谱几乎完全重叠于供体Ｎｂ２８的归??一化荧光发射光谱内，且ＯＴＡ／ＯＴＢ和Ｎｂ２８的荧光发射光谱无明显交叉，因此??证明ＯＴＡ／ＯＴＢ和Ｎｂ２８同时存在于均相水溶液中将发生有效ＦＲＥＴ反应。??１９??
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本文编号：2845130