壳寡糖单体的肠道吸收特征及其机制研究

发布时间：2020-10-20 20:36

【摘要】：壳寡糖作为一种重要的功能性低聚糖,具有提高机体免疫、肝脏保护和肿瘤抑制等重要生理活性,是一种重要的新食品原料。但目前壳寡糖在肠道中的吸收机制及跨膜转运过程并不明确,限制了对其生理活性的深入研究与产品开发。本课题旨在通过构建翻转肠囊模型及人肠Caco-2单层细胞吸收模型,开展单一聚合度壳寡糖体外吸收及生物利用的研究,阐明不同聚合度壳寡糖单体肠道吸收特征及跨膜转运机制,确定壳寡糖的胞内累积位点,为进一步深入了解其吸收特征及代谢过程等提供理论支持。首先,搭建了小肠翻转模型,采用葡萄糖验证了转运模型的可行性,并采用乳酸脱氢酶法和石蜡切片法确定壳寡糖孵育时间及浓度。壳寡糖经小肠吸收量由HPLC-ELSD方法检测。结果表明:从小肠石蜡切片实验组与对照组结果可知,在100min以内,小肠组织紧密性好,绒毛结构较完整。由LDH酶活性实验可知,三种实验浓度下LDH酶活性均只在120 min时增大至对照组的1.5倍。确定后续壳寡糖孵育时间为100 min,孵育浓度为2 mg/mL,4 mg/mL,8 mg/mL。其次,采用翻转肠囊模型,探究了浓度、时间、SGLTs和GLUT2主动转运蛋白对不同聚合度壳寡糖单体吸收的影响。结果表明,不同聚合度壳寡糖单体在大鼠外翻肠囊内的转运量在2 mg/mL和4 mg/mL浓度范围内与浓度无明显相关性;8 mg/mL浓度下的转运量与浓度呈线性相关。由此推测,在中低浓度(≤ 4 mg/mL)壳寡糖孵育下,壳寡糖主要通过载体蛋白转运;在较高浓度(8 mg/mL)壳寡糖孵育下,壳寡糖的膜转运机制为被动扩散。在GLUT2转运蛋白抑制剂加入后,壳二糖的表观渗透系数由(13.99±0.40)×10-6cm/s降至(11.30±0.12)×10-6cm/s,抑制率为19%;壳三糖由(9.33±0.04)×10-6 cm/s降至(7.62±0.30)×10-6 cm/s,抑制率为18%;壳四糖及壳五糖分别由(12.43±0.17)×10-6cm/s和(6.62±0.18)×10-6cm/s降至(9.72±0.17)×10-6 cm/s和(5.92±0.01)×10-6 cm/s,抑制率分别为22%和26%。而加入SGLTs转运蛋白抑制剂后,只有壳四糖和壳五糖的累积渗透量显著降低,抑制率分别为9%和11%。GLUT2转运蛋白抑制剂抑制效果优于SGLTs转运蛋白抑制剂,说明壳寡糖主要通过GLUT2途径进行跨膜转运。再次,利用Caco-2细胞模型验证不同聚合度壳寡糖单体的吸收机制。采用MTT法确定壳二糖至壳五糖对Caco-2细胞存活率影响。结果表明,2 mM以下的壳寡糖体外孵育4h对Caco-2细胞存活率无明显影响,故选取0.5、1、2 mM作为Caco-2转运实验孵育浓度。在中低浓度(0.5,1mM)下,壳寡糖转运量与浓度无关;在高浓度(2 mM)时,转运量明显增大。同时壳二糖至壳五糖的PDR值均大于1.5,说明壳二糖至壳五糖均存在主动转运。细胞模型中的结果和小肠翻转模型实验结果一致,说明壳寡糖在小肠内通过多种方式吸收,被动扩散以及载体蛋白转运并存。主动转运蛋白抑制实验同样表明,GLUT2转运蛋白均参与壳二糖至壳五糖的转运,而SGLTs转运蛋白仅参与壳四糖及壳五糖的转运,壳二糖至壳五糖均优先通过GLUT2转运途径吸收。最后,采用荧光显微镜探究壳二糖及壳五糖进入Caco-2细胞后的定位情况。结果显示,壳二糖及壳五糖入胞呈浓度依赖。中低浓度(10、100 μM)壳二糖及壳五糖处理,其在细胞内呈点状分布,或富集在核膜或富集于细胞膜表面;高浓度(500 μM)孵育壳二糖及壳五糖后,其在Caco-2细胞质内均呈弥散分布。壳二糖入胞的速度比壳五糖更快,10 min即可进入细胞,而孵育30 min后,壳五糖的荧光信号才可被检测。在体外吸收240 min内,壳二糖和壳五糖不会被细胞内溶酶体降解,且两者均能聚集于内质网与线粒体。壳二糖优先定位于内质网,壳五糖则优先定位于线粒体。揭示壳寡糖可能通过调控内质网及线粒体相关信号通路发挥生理活性。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.2
【图文】：

且通过石蜡切片法和乳酸脱氢酶法确定壳寡糖孵育浓度及时间。??（２）壳寡糖体外吸收机制研究??验证模型的可行性及确定壳寡糖孵育浓度和时间后，探究不同聚合度壳寡糖单体在??小肠黏膜内的吸收量，以及浓度对壳寡糖转运的影响，此外还研宄在添加ＳＧＬＴｓ抑制??剂根皮苷及ＧＬＵＴ２抑制剂根皮素后壳寡糖的吸收量，确定主动转运蛋白是否参与壳寡??糖吸收过程以及不同抑制剂对不同聚合度壳寡糖单体吸收的影响。??（３）壳寡糖吸收转运特点验证研宄??首先确定不同聚合度壳寡糖单体对Ｃａｃｏ－２细胞的毒性，确定细胞安全载量后探宄??不同聚合度壳寡糖单体的吸收过程，验证聚合度、浓度以及主动转运抑制剂对壳寡糖吸??收的影响，确定壳寡糖的吸收规律及特点。??（４）壳二糖及壳五糖在细胞内的亚定位研究??利用荧光显微镜对胞内荧光强度及分布进行监测，并对胞内早、晚期线粒体、溶酶??体及内质网进行荧光共定位，初步确定壳二糖及壳五糖吸收入胞后的累积位点。??１．４．３技术路线??本课题的技术路线如图１．２所示：??不同聚合度壳荔糖的??

用皮筋固定，将注射器头部与套管连接，在肠囊内侧加入６ｍＬＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ液，并将??空肠段置于装有２５?ｍＬ?２?ｍｇ／ｍＬ不同聚合度壳寡糖单体工作液的烧杯中，３７°Ｃ水浴（实??验装置示意图见图２．１）。整个翻转过程在冰盒上进行，且持续通氧气与二氧化碳的混??合气体。每隔２０１１１丨１１，取５００此小肠内溶液，并用等量１＾说８－１１丨１职１＇补足，收集至１００??ｍｉｎ〇????９５％（Ｘ＋５０／〇Ｃ０２??Ｔ广．—??？１?Ｐ３！?注射器??橡胶塞?￣?￣?￣７??Ｖ???＊?????????一????￣????????士内細?——?壳寡糖（２５ｍＬ）??亂甩?ＴＯ＊?…??Ｑ?ｂ???????Ｋｒｅｂｓ－ｒｉｎｇｅｒ?液（６ｍＬ）??水浴（３７。〇????外翻肠囊??图２．１体外翻转小肠实验装置图??Ｆｉｇ．?２．１?Ａｐｐａｒａｔｕｓ?ｕｓｅｄ?ｉｎ?ｖｉｔｒｏ?ｅｖｅｒｔｅｄ?ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ??计算渗透量（＾＾／〇１１）与表观渗透系数（？＃１３）；并按“２．２．３．２壳寡糖定性及定量分??析方法”测定壳寡糖的吸收浓度。实验结束后，将翻转肠段沿插管两端剪下，测量实验??肠段的长度（Ｌ）及其空肠段内径（Ｒ）。??肠段的选择：从距离幽门ｌｃｍ处开始，向下延伸约１５?ｃｍ的肠段为空肠，从此处??开始向下取两段约１２ｃｍ的空肠段。??２．２．３．４石蜡切片法??按照“２．２．３．３小肠翻转模型”中小肠处理方法，取出小肠后分别置于２、４、８ｍｇ／ｍＬ??通氧气／二氧化碳混合气体的壳寡糖工作液中（２５ｎｉＬ）

测定还原糖的基本方法。本实验中，标准曲线浓度范围为０－０．６?ｍｇ／ｍＬ，在此范围内，??吸光值在０．８左右，数据准确。标准曲线方程为：ｙ＝Ｌ４５３２ｘ－０．０３６８．Ｒ２＝０．９９８２，相关性??好。葡萄糖在大鼠肠囊内的吸收量如图２．２所示。由图可知，葡萄糖在体外吸收１２０?ｍｉｎ??后，渗透量达到２．２４?±０．２３?ｐｇ／ｃｍ；添加抑制剂实验组，葡萄糖吸收量显著降低，渗透??量为１．７５?±０．１１?ｐｇ／ｃｍ，抑制率为２２％。随着时间的增加，葡萄糖吸收量逐渐累积，表??现为时间依赖。对比未外加根皮苷抑制剂实验组，外加抑制剂实验组每个时间点葡萄糖??的吸收量均显著降低。根皮苷抑制剂是钠－葡萄糖转运蛋白（ＳＧＬＴｓ）的抑制剂，抑制葡??
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本文编号：2849129