苦瓜活性肽的分离鉴定及抗非小细胞肺癌活性及机制研究

发布时间：2020-10-21 04:24

　　 背景:目前肺癌发病率高,肿瘤相关死亡率在全球位居第一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)大约占肺癌患者的85%,是最常见的组织学类型。针对非小细胞肺癌的治疗手段主要包括手术、放疗和化疗等,其中以铂剂为主的化疗方案是临床上应用的主要方案,但疗效有限,仅能使Ⅲ、Ⅳ期患者死亡风险下降26-32%,患者中位生存期大概只有8-10个月。大部分NSCLC患者被诊断时已经丧失了手术机会,5年生存率只有2%。近些年分子靶向治疗取得了突飞猛进的发展,例如,吉非替尼(ZD1839,Iressa),一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI),2003年获FDA批准,可以阻断EGFR下游信号的传导,促使肿瘤萎缩,表现出良好的初始响应及极好的抗癌作用。然而,肿瘤耐药性的产生大大减弱了药物疗效,使用药剂量明显增加。而大剂量用药又会导致正常细胞受到不同程度的伤害。因此,研发更加低毒、高效的抗NSCLC药物、找到新的作用靶点具有重要的科学及临床价值。人们探索蛋白质活性已具有数百年的历史。研究表明蛋白质的生物有效性与其氨基酸含量、氨基酸序列及空间结构等具有较大的相关性,研究发现药用动、植物中存在着大量具有药理活性的蛋白质、多肽类物质,这些蛋白质、多肽具有开发为抗癌药物的巨大潜力。苦瓜是一种具有苦味的植物果实,在中医药应用中被广泛用于治疗各种疾病,如肿瘤、炎症、糖尿病等。苦瓜提取物已被证实在治疗肿瘤中发挥重要的作用,具有抗肿瘤细胞增殖和迁移的功效。然而,迄今为止,尚未有关于苦瓜活性肽用于癌症治疗的报道,有待进一步研究。目的:本研究将通过活性追踪的方式分离、鉴定苦瓜活性肽并将其氨基酸序列进行鉴定分析,并研究其对非小细胞肺癌A549、L78、PGCL3、H460和NCI-H1299细胞株的抗增殖活性及其诱导A549细胞凋亡的作用机制。方法:1、苦瓜活性肽的分离及氨基酸序列采用硫酸铵分级沉淀(50%-80%饱和度)、超滤(截留分子质量1kDa)和冷冻干燥技术获得蛋白粗提物(组分Ⅰ)。将组分Ⅰ通过疏水色谱、阴离子交换色谱、凝胶色谱及反相高效液相色谱等方法获得苦瓜活性肽。整个纯化过程中采用280nm检测苦瓜活性肽的洗脱情况并收集,采用MTT法检测收集到的苦瓜活性肽的抗肿瘤细胞增殖活性。2、MTT细胞增殖实验检测肺癌细胞A549、L78、PGCL3、H460、NCI-H1299和正常肺纤维细胞CCD19增殖改变,分析MCL0-12对NSCLC细胞的选择性杀伤作用。3、AnnexinV/PI双染细胞凋亡检测方法、凋亡检测试剂盒检测MCL0-12对A549细胞凋亡和细胞周期的影响。4、不同浓度MCL0-12处理A549细胞48h,线粒体膜电位检测试剂盒、活性氧(ROS)试剂盒检测A549细胞线粒体膜电位和细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化情况,Western blotting检测促凋亡和抗凋亡蛋白的表达情况。结果:1、本研究共分离得到28种苦瓜活性肽,并解析了其氨基酸序列。其中,MCL0-12抗肿瘤活性最强,HPLC-ESI-MS质谱结果表明其分子质量为811.3761Da,氨基酸序列为FHGKGHE。2、苦瓜活性肽能显著抑制NSCLC细胞的增殖,但是对正常肺纤维细胞则无增殖抑制作用;其中,MCL0-12对A549细胞增殖抑制活性最强,IC50值为21.4±2.21mM,对正常肺纤维细胞的IC50200mM。3、AnnexinV/PI双染细胞凋亡结果显示10.7、21.4、42.8mM MCLO-12能显著诱导细胞凋亡,且以晚期细胞凋亡为主,浓度越大,晚期凋亡比例越高。细胞周期分析结果显示MCL0-12能将A549细胞阻滞在GO/G1期。4、MCL0-12增加细胞内ROS水平、诱导线粒体膜电位水平下降:MCL0-12处理A549细胞后,ROS显著增加,且呈现剂量、时间依赖性。MCL0-12处理的A549细胞,线粒体膜电位显著降低,其中,42.8mM MCL0-12处理后,其线粒体膜电位水平下降最为明显。5、Western blotting 结果显示 MCLO-12 通过调控 Caspase3、Caspase9 及PARP诱导细胞凋亡,这些酶与细胞死亡过程紧密相关。MCLO-12影响Trx系统及MAPK信号传导通路:MCLO-12通过抑制TrX系统,激活ASK1、MAPK通路增加胞内ROS水平,最终诱导细胞凋亡。结论:1、MCLO-12对NSCLC细胞具有选择性杀伤作用,能够诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期。2、MCLO-12通过线粒体通路诱导A549细胞凋亡,导致线粒体膜电位水平下降;另外,还能通过抑制TrX系统导致ROS蓄积,进而激活一系列由TrX介导的信号通路,包括ASK1,MAPK-p38及JNK等,诱导细胞凋亡。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R734.2;TS201.4
【部分图文】：

凋亡的起点。Ｐ３８，作为ＭＡＰＫ通路的另一成员，当ＲＯＳ生成增加时也会参与凋亡??信号传递。Ｐ３８和ＪＮＫ都可被ＡＳＫ－１激活，后者的活性由它与硫氧还蛋白的相互??作用所控制［７＂：：］。图１显示了?ＲＯＳ发挥抗癌效应时涉及的相关机制及通路［？。??提高ＲＯＳ水平更适合治疗哪种类型的恶性肿瘤需要进一步研究，因为各种类型的??肿瘤特点不同，且治疗反应也不同。??１２??

研宄显示，激活细胞的ＥＲＫ通路可以使凋亡减少，而ＪＮＫ及Ｐ３８ＭＡＰＫ通??路则会诱导死亡。ＥＲＫ与ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ之间保持着稳定性，进而影响着细胞的??命运。图２显示了外界刺激通过线粒体内源性途径及激活ＥＲＫ／ＭＡＰＫ通路诱导凋亡??的分子机制［９４］。??１４??

结果??１．抗肿瘤蛋白鉴定??通过以上分离纯化过程，流程图见图３，最终得到２８种抗肿瘤蛋白，通过??ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ进行氨基酸序列分析及鉴定。在这个条件下，肽段经常质子化，因??为能量较低，肽段裂解经常发生在酰胺键之间，而不是侧链的化学键。因此，当??碰撞能量＜２〇〇ｅＶ，?ｂ和ｙ离子是主要裂解离子。我们通过ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ对ＭＣＬ０－１２??进行了分子量测定及肽段特征分析，该组分的分子量为８１１．?３７６１Ｄａ?（见图４）。??碎片离子?ｍ／ｚ?２８５．?１３２５?是?ｙ５?离子，ｍ／ｚ?４７０．?２４６１?是?ｂ３?离子，ｍ／ｚ?５２７．?２５８１??是?ｙ３?离子。ｍ／ｚ?７９３．?３７２９?是碎片离子［Ｍ－ＮＨ２＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ?６６４．?３２５４?是?ｂｌ?离子。基??于此，我们得出结论，ＭＣＬＯ－１２的氨基酸序列为ＦＨＧＫＧＨＥ，另外，通过ＭＳ／ＭＳ质??谱分析
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本文编号：2849635