鲣鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽的酶解制备及功能活性评价

发布时间：2020-10-22 08:20

　　 高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)及痛风是由长期血尿酸水平升高引起的一类代谢性疾病。目前用于治疗高尿酸血症的西药普遍存在较明显的毒性不良反应。因此,开发高效低毒的降尿酸活性物质具有重要的意义。铿鱼(Skipjack tuna),俗称炸弹鱼,属于金枪鱼科,具有高蛋白、低脂肪等特点,是制备生物活性肽的良好来源。本文以鲣鱼背腹肉为原料,运用可控酶解技术制备鲣鱼黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)抑制肽,利用膜分离及亲和超滤-液质技术对其进行分离纯化及结构鉴定,最后通过分子对接技术分析其构效关系。主要研究结果如下:(1)筛选了酶解优化用的原料——鲣鱼背腹肉。建立了测定肌肽、鹅肌肽含量的高效液相色谱法:采用氨基柱,流动相为50mM pH 6.8磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲溶液:乙腈=4:6,流速为lmL/min,柱温为25 ℃,检测波长为210nm。分别测定了鲣鱼六个不同部位中肌肽、鹅肌肽的含量,发现鲣鱼背腹肉中含量最高,故适合作为酶解底物。同时,测定鲣鱼背腹肉的水分含量为70.43%,粗蛋白26.83%,灰分1.63%,脂肪1.36%,是一种高蛋白、低脂肪且营养丰富的食品来源。(2)确定了酶解制备鲣鱼XOD抑制肽的最佳工艺条件。以水解度、氮回收率、XOD抑制活性、肌肽和鹅肌肽含量为响应值,对酶解工艺中蛋白酶种类、加酶量、酶解pH和温度等影响因素进行了优化,得到酶解的最优工艺为:采用中性蛋白酶,加酶量为489.86 U/g,酶解pH为7.08,温度为49.5 ℃,时间为5 h。在此条件下,鲣鱼酶解产物的水解度为22.38%,氮回收率为83.31%,XOD抑制活性达到62.26%,肌肽和鹅肌肽含量分别为0.50 mg/g和24.50 mg/g(以干基计),与模型方程理论预测值基本一致。由本法所得的鲣鱼XOD抑制肽以分子质量低于1000 Da的寡肽为主。皮尔逊相关性分析表明,XOD抑制活性与肌肽或鹅肌肽含量无相关性,推测在酶解的过程中产生了其他具有XOD抑制活性的小分子肽。(3)膜分离鲣鱼XOD抑制肽并进行多种功能评价。采用1000、600和300 Da的聚酰胺膜对酶解优化得到的鲣鱼XOD抑制肽进行膜分离,功能活性评价结果发现600～1000 Da组分的XOD抑制活性最高,其IC50值是9.18 mg/mL,同时,该部分的抗氧化活性也最高,说明这部分产物能够在减少尿酸生成的同时减缓伴随产生的氧化应激造成的损伤;300～600 Da组分的血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性最高,IC50 值为 0.12 mg/mL。(4)亲和超滤-液质技术分离鉴定得到具有XOD抑制活性的五肽——Ala-Cys-Glu-Cys-Asp(ACECD)。人工合成后证实,ACECD具有较强的XOD抑制活性,其IC50值为7.23 mg/mL。分子对接结果显示,ACECD能够进入XOD中含Mo原子的活性中心,并通过氢键、疏水作用力及范德华力等与活性中心周围的氨基酸残基产生相互作用,与XOD催化底物黄嘌呤之间存在竞争同一结合位点的现象。以上研究结果表明鲣鱼蛋白肽具有潜在的降尿酸作用,值得进一步深入挖掘。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS254.4
【部分图文】：

或高嘌呤类食物所致［＞ｕ］。??体内尿酸的生成主要由嘌呤类代谢相关酶控制，而尿酸的排泄主要由尿酸重??吸收蛋白和尿酸分泌蛋白调控（见图１．１）。??１??

２．４结果与讨论??２．４．１肌肽、鹅肌肽色谱图及标准曲线??肌肽、鹅肌肽标准品色谱图见图２．１。鹅肌肽标准品保留时间为１８．１０３?ｍｍ，??肌肽标准品保留时间为２２．６２０?ｍｉｎ，两者可以实现较好的分离。取２．３．１中不同??浓度的肌肽、鹅肌肽混合标准品，分别进行测定分析，得到肌肽、鹅肌肽标准??品的标准曲线，如图２．２所示。将曲线进行回归分析，得到鹅肌肽回归方程为：??ｙ＝０．５８６２ｘ＋９．３２６４，?Ｒ２＝０．９９８２；肌肽回归方程为：ｙ＝０．９４２４ｘ＋１７．９８４，?Ｒ２＝０．９９８０。??２５００－?１４．３?２６３??２０００－??置祕??Ｉ?鹅肌肽?肌肽??Ｉ?１０００－??＜?＼?＼?．?｜２９?－?２２?６２０??３－３１６０?＼Ｗ２６－１８?１０３?＾?Ａ??＾?Ｊ??〇．?６?７７５?ｉ＾ｉａｉ〇ｇｅｉ５２?ｉ?｜?？尸？戈３?，??？５ＱＱＪ｜＿－?■?－■－丨－．…■?■?．．?■?．?■．．．－—??０．０?５．０?１０．０?１５．０?２０．０?２５．０?３０．０??时?Ｍ?［ｍｉｎｉ??图２．１肌肽及鹅肌肽标准品液相色谱图??Ｆｉｇ．?２．１?Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，?ｃａｒｎｏｓｉｎｅ?ａｎｄ?ａｎｓｅｒｉｎ

２．４结果与讨论??２．４．１肌肽、鹅肌肽色谱图及标准曲线??肌肽、鹅肌肽标准品色谱图见图２．１。鹅肌肽标准品保留时间为１８．１０３?ｍｍ，??肌肽标准品保留时间为２２．６２０?ｍｉｎ，两者可以实现较好的分离。取２．３．１中不同??浓度的肌肽、鹅肌肽混合标准品，分别进行测定分析，得到肌肽、鹅肌肽标准??品的标准曲线，如图２．２所示。将曲线进行回归分析，得到鹅肌肽回归方程为：??ｙ＝０．５８６２ｘ＋９．３２６４，?Ｒ２＝０．９９８２；肌肽回归方程为：ｙ＝０．９４２４ｘ＋１７．９８４，?Ｒ２＝０．９９８０。??２５００－?１４．３?２６３??２０００－??置祕??Ｉ?鹅肌肽?肌肽??Ｉ?１０００－??＜?＼?＼?．?｜２９?－?２２?６２０??３－３１６０?＼Ｗ２６－１８?１０３?＾?Ａ??＾?Ｊ??〇．?６?７７５?ｉ＾ｉａｉ〇ｇｅｉ５２?ｉ?｜?？尸？戈３?，??？５ＱＱＪ｜＿－?■?－■－丨－．…■?■?．．?■?．?■．．．－—??０．０?５．０?１０．０?１５．０?２０．０?２５．０?３０．０??时?Ｍ?［ｍｉｎｉ??图２．１肌肽及鹅肌肽标准品液相色谱图??Ｆｉｇ．?２．１?Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，?ｃａｒｎｏｓｉｎｅ?ａｎｄ?ａｎｓｅｒｉｎ
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 赵谋明;徐巨才;刘洋;赵容钟;吴长平;苏国万;;秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺优化[J];农业工程学报;2015年14期

2 童铃;金毅;徐坤华;戴志远;;3种鲣鱼背部肌肉的营养成分分析及评价[J];南方水产科学;2014年05期

3 刘舒;邢俊鹏;闫峻;宋凤瑞;刘志强;刘淑莹;;中药黄芩中神经氨酸酶抑制剂的超滤质谱筛选研究[J];化学学报;2011年13期

本文编号：2851348