反式肉桂醛对意大利青霉菌的抑制机理研究

发布时间：2020-11-03 07:29

　　 植物源精油是一种新型抑菌剂,但是它的抑菌机理研究尚且停留在表层。本文研究了肉桂精油的主要成分反式肉桂醛的抑真菌机理。结果发现反式肉桂醛的抑真菌机理是通过破坏细胞膜进而抑制菌丝体生长,同时它还能破坏线粒体的功能,引发线粒体介导的细胞凋亡。另外,作为全新的高灵敏度指纹性分析手段,拉曼光谱技术被运用到了精油的抑真菌机理分析上。抑菌机理的研究有助于更好的开发出高效的天然抑菌剂。具体研究结果如下:首先,反式肉桂醛通过膜损伤机制发挥抑制菌丝体生长的功效。反式肉桂醛可以改变细胞膜的通透性导致细胞内容物质的泄漏,比如核酸、蛋白质、钾离子等物质。细胞可以被碘化丙啶染成红色,表明细胞膜的整体性下降,最低由100.0±1%降至12.1±3%。同时,扫描电镜结果显示处理后的菌丝表面出现凹凸不平的褶皱,细胞的形态学特征发生改变。然后,反式肉桂醛破坏了线粒体的正常功能并引发线粒体介导的细胞凋亡。通过改变三羧酸循环的相关酶活使三羧酸循环失调,具体表现为柠檬酸的含量先上升后下降,琥珀酸脱氢酶的活力下降,由107.8±2.2 U最低降至52.7±5.3 U,苹果酸脱氢酶的活力上升,由4.8±0.5 U最高上升至15.2±0.9 U。线粒体内部呼吸链的电子大量泄漏,细胞内部活性氧水平急剧升高,氧化还原水平失调。反式肉桂醛通过破坏线粒体膜整体性,引发线粒体膜电位的崩塌,导致细胞色素c泄漏,从而引发了凋亡蛋白酶的活化,具体表征为Caspase-3的活力由3.6±0.6 U上升至8.8±1.1 U,而后凋亡反应级联放大,细胞凋亡。最后,将灵敏度高、能提供指纹信息的拉曼光谱技术引入到精油抑真菌机理研究过程中。拉曼光谱和表面增强拉曼光谱方法在检测精油抑菌过程中细胞内部、外部的变化时,能发挥良好的诊断作用。利用表面增强拉曼光谱快速检测出细胞蛋白质、核酸和脂质的泄漏。具体表现为,胞外上清液中蛋白质的特征峰1244 cm~(-1)峰强上升;核酸的特征峰734 cm~(-1)、1330 cm~(-1)、1338 cm~(-1)皆同时上升;另外,代表脂质的特征峰1466 cm~(-1)的强度也上升。用共聚焦显微拉曼光谱仪检测线粒体中细胞色素c时,发现其特征峰强度指标I_(750)/I_(2944)下降,表示线粒体内细胞色素c的量减少。另外,拉曼峰强可以与OD_(260)值、蛋白质泄漏量和细胞色素c泄漏量等经典分析方法之间建立强相关性,相关性系数都在0.9以上。以上研究结果表明,反式肉桂醛通过破坏细胞膜发挥抑制意大利青霉菌菌丝生长的作用;通过激活线粒体介导的细胞凋亡途径发挥抑菌功效;拉曼光谱和表面增强拉曼光谱技术可以很好的表征精油抑真菌过程中的物质变化。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS255.3;TS202.3
【部分图文】：

1 绪 论示，用激光照射样品后，入射光在样品上发生拉曼散得到目标分子相应的拉曼图谱。该方法提供了关于药中的直接定量数据以及药物-靶标反应的细节信息。拉维酸和他唑巴坦渗入大肠杆菌细胞，随后抑制细胞肠杆菌细胞含有与抑制剂形成稳定复合物的 β-内酰胺物的拉曼特征。从拉曼强度来看，很容易半定量地测克拉维酸分子的数量。

图 1-2 表面增强拉曼光谱在抑菌过程中的应用原理示意图g. 1-2 Schematic diagram of application principle of surface-enhanced Raman spectroscopbacteriostatic process SERS 的单细胞分析也是当前研究的热点[62]，单细胞分析为从分子水平或平上研究抑菌机制提供了可能性，如若能将 SERS 联合同位素标记法[63]，像技术则能实现从单分子水平考察目标分子在细胞内的变化和分布[50,64,6是一个活跃的研究领域，目的是希望从单个活细胞中解读群体生化过程。光谱技术已经越来越多地用于单细胞分析，其能够以非接触、非侵入性和式提供关于活细胞中发生的分子过程的实时动态信息。例如 Kuku G 等人基于表面增强拉曼光谱的纳米粒子毒性评估的新方法。在两个模型细胞系模型 NM，并且通过 WST-1 细胞毒性测定和膜联蛋白 V-FITC/碘化丙啶染亡-坏死实验进行验证。结果表明，SERS 可检测细胞毒性，评估绕过 NM耗费的人力物力更少。的，SERS 作为一种非侵入性技术，自然可以检测线粒体膜内膜外的许多重

1 绪 论TC 的氧化还原状态和 Cytc 的构象。他们首先构建了银纳米粒子混合，将银纳米粒子附着在线粒体表面，光谱，该光谱提供了活的线粒体内膜电位、质子梯度和为的特征信息。银粒子在线粒体表面的附着情况如下及膜间隙的厚度为 SERS 检测 Cytc（图中蓝色球）提在于它只能用于研究在分离线粒体中的 Cyt c，而不，因为纳米结构不能被内吞。
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本文编号：2868278