日本黄姑鱼肉活性肽的制备及其免疫调节作用研究

发布时间：2021-02-23 05:16

　　日本黄姑鱼（Nibea japonica）,俗称黑毛鲿,属于黄姑鱼属,主要分布在中国东海和日本南部海。日本黄姑鱼味道鲜美,营养丰富,但作为蛋白来源用于提取制备免疫活性肽的研究鲜为报道。本文以日本黄姑鱼鱼肉为原料,用酶解法提取日本黄姑鱼肉粗肽,经过超滤比较各截留组分的免疫活性,将免疫活性最高的<1 kDa的组分命名为日本黄姑鱼肉活性肽（Nibea japonica peptides,NJP）。研究NJP在体内体外水平的免疫调节作用,最后将NJP经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱,Sephadex G25凝胶柱和RP-HPLC进行进一步的分离纯化。结果表明:（1）酶解法提取日本黄姑鱼肉粗肽的最佳用酶为木瓜蛋白酶。通过单因素及响应面优化,最优提取工艺参数为:料液比1:11 g/mL、pH 6、温度59°C、时间5.4 h。在此条件下,酶解肽对巨噬细胞RAW 264.7的相对增殖率为62.3%。（2）探讨NJP对巨噬细胞RAW 264.7的免疫调节作用。NJP对细胞无明显毒性,并且可显著提高巨噬细胞的增殖能力、吞噬功能、NO分泌量以及细胞因子（IL-6、IL-1β... 

【文章来源】：浙江海洋大学浙江省

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略语
第一章 前言
    1.1 海洋生物活性肽的概述
    1.2 海洋生物活性肽的功能
        1.2.1 免疫调节作用
        1.2.2 抗氧化作用
        1.2.3 降血压作用
        1.2.4 抗癌作用
    1.3 免疫活性肽
        1.3.1 免疫活性肽的制备
        1.3.2 免疫活性肽分离纯化
    1.4 本课题研究的意义及内容
        1.4.1 本课题研究的意义
        1.4.2 本课题研究的主要内容
第二章 日本黄姑鱼肉活性肽酶解工艺研究
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 材料与试剂
        2.1.2 仪器与设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养
        2.2.3 日本黄姑鱼肉粗肽提取工艺流程
        2.2.4 日本黄姑鱼肉粗肽的酶解制备
    2.3 结果与分析
        2.3.1 蛋白酶的筛选
        2.3.2 单因素试验
        2.3.3 响应面试验
        2.3.4 验证实验
    2.4 讨论
第三章 日本黄姑鱼肉活性肽对巨噬细胞RAW264.7 的免疫调节作用的研究
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 材料与试剂
        3.1.2 仪器与设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞培养
        3.2.2 日本黄姑鱼肉粗肽的制备
        3.2.3 日本黄姑鱼肉粗肽的分子量分布测定
        3.2.4 NJP的制备
        3.2.5 NJP对巨噬细胞RAW264.7 的免疫作用
        3.2.6 数据处理
    3.3 结果与分析
        3.3.1 日本黄姑鱼肉粗肽分子量分布的测定
        3.3.2 NJP的制备
        3.3.3 NJP对细胞受损的影响
        3.3.4 NJP检测细胞增殖实验
        3.3.5 NJP对细胞形态变化的影响
        3.3.6 中性红测定NJP对巨噬细胞RAW264.7 吞噬的影响
        3.3.7 NJP对巨噬细胞RAW264.7 分泌NO的影响
        3.3.8 NJP对巨噬细胞RAW264.7 分泌细胞因子的影响
        3.3.9 NJP对巨噬细胞RAW264.7 周期的影响
    3.4 结论与讨论
第四章 日本黄姑鱼肉活性肽对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响
    4.1 材料与仪器
        4.1.1 材料与试剂
        4.1.2 仪器与设备
        4.1.3 实验动物
    4.2 方法
        4.2.1 模型的建立与分组
        4.2.2 NJP对小鼠体重的影响
        4.2.3 NJP对小鼠胸腺和脾脏指数的影响
        4.2.4 NJP对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
        4.2.5 NJP对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响
        4.2.6 迟发型变态反应
        4.2.7 NJP对小鼠血清中IL-2、IFN-γ和 TNF-α含量的检测
        4.2.8 NJP对小鼠血清中免疫球蛋白检测
        4.2.9 小鼠体内抗氧化活性的检测
        4.2.10 数据处理
    4.3 结果与分析
        4.3.1 NJP对小鼠体重的影响
        4.3.2 NJP对小鼠胸腺和脾脏指数的影响
        4.3.3 NJP对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
        4.3.4 NJP对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响
        4.3.5 NJP对小鼠迟发型变态反应的影响
        4.3.6 NJP对小鼠血清中IL-2、IFN-γ和 TNF-α含量的检测
        4.3.7 NJP对小鼠血清免疫球蛋白检测
        4.3.8 小鼠体内抗氧化活性的检测
    4.4 结论与讨论
第五章 日本黄姑鱼肉活性肽分离纯化
    5.1 材料与仪器
        5.1.1 材料与试剂
        5.1.2 仪器与设备
    5.2 实验方法
        5.2.1 日本黄姑鱼肉粗肽的提取
        5.2.2 NJP的制备
        5.2.3 巨噬细胞RAW264.7 增殖实验
        5.2.4 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析分离
        5.2.5 Sephadex G-25 凝胶柱层析分离
        5.2.6 高效液相分离纯化
        5.2.7 目标肽的N端测序
        5.2.8 实验数据处理
    5.3 结果与分析
        5.3.1 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子柱层析分离结果
        5.3.2 Sephadex G-25 凝胶柱层析分离结果
        5.3.3 高效液相分离纯化结果
    5.4 结果与讨论
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 研究的创新点
    6.3 进一步研究
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文及研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]外源添加物对日本黄姑鱼鱼糜制品凝胶特性的影响[J]. 陈瑜,张小军,丁国芳,朱俊向,王世光.  食品科技. 2018(12)
[2]文蛤寡肽对RAW264.7细胞的免疫调节作用[J]. 叶蕾,阎洁,张文,邹舒舒,叶盛旺,杨最素,余方苗,丁国芳.  水产学报. 2019(02)
[3]食源性免疫活性肽的研究进展[J]. 李浩然,高丹丹,陈桂芳,李明生,马忠仁.  食品工业科技. 2018(22)
[4]青蛤酶解多肽对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用[J]. 叶盛旺,杨最素,李维,唐云平,黄芳芳,张小军,余方苗,丁国芳.  食品科学. 2019(07)
[5]3种日本黄姑鱼放流标志方法的比较[J]. 徐开达,王好学,姜亚洲,胡翠林,王忠明,卢占晖,朱文斌,柴学军,周永东.  厦门大学学报(自然科学版). 2018(03)
[6]绿侧花海葵（Anthopleura anjunae）寡肽制备的关键技术与抗前列腺癌作用研究[J]. 吴宗泽,丁国芳,杨最素,余方苗,唐云平,贾盈露,郑媛媛,陈锐.  海洋与湖沼. 2017(05)
[7]抗癌肽研究进展[J]. 岳硕豪,田弛,胡元昭,张军林.  生物技术通报. 2017(11)
[8]马氏珠母贝免疫活性肽的纯化与鉴定[J]. 邓志程,张迪,吉宏武,曹文红,苏伟明.  广东海洋大学学报. 2017(04)
[9]文蛤多肽的制备及对非酒精性脂肪肝细胞模型的修复作用[J]. 赵莎莎,赵玉勤,张亚茹,杨最素,黄芳芳,丁国芳.  中国食品学报. 2017(06)
[10]生物活性肽的制备及分离纯化方法研究进展[J]. 李璇,杜梦霞,王富龙,申明月,谢建华,谢明勇.  食品工业科技. 2017(20)

博士论文
[1]黑灵芝多糖的免疫调节活性及其作用机制[D]. 余强.南昌大学 2014
[2]鳕鱼免疫活性肽的可控制备及其免疫活性研究[D]. 侯虎.中国海洋大学 2011



本文编号：3047075