基于免疫磁分离的金黄色葡萄球菌RPA-LF快速检测方法的建立
发布时间：2021-04-02 23:29
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SP）作为食源性致病菌在自然界中广泛存在,其易污染肉制品、蔬菜等食品。由于缺乏有效、快速和可视化的检测方法,金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件时有发生。故亟需建立一种快速、灵敏可大批量应用的检测方法。目前,关于金黄色葡萄球菌的检测方法普遍存在周期较长,设备昂贵,不利于基层现场大批量检测等不足。免疫磁分离（Immunomagnetic separation,IMS）方法可显著浓缩目的细菌,降低食品基质和杂菌对于后期检测的干扰,提高检测效率。重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification,RPA）具有快速、便捷、高效和廉价等优点。本研究建立了一种基于免疫磁分离的金黄色葡萄球菌RPA-LF（Lateral flow,LF）快速检测技术,为金黄色葡萄球菌的检测提供新的技术方案。为了制备可用于金黄色葡萄球菌检测的特异性单抗,本研究将甲醛灭活的4株不同来源的金黄色葡萄球菌（ATCC6538、ATCC29213、CMCC26003和SH001）等量混合物作为全菌免疫原,免疫BALB/c小鼠。采集...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于单壁碳纳米管检测及黄色葡萄球菌的传感器制备原理图
1.2.2 磁珠的应用1.2.2.1 细菌分离免疫磁珠分离技术被广泛应用于复杂基质中的细菌分离(图1-2)。磁珠偶联抗体的方式分为直接偶联法和间接偶联法。直接偶联法是指抗体共价结合在羧基磁珠表面。首先将磁珠表面上的羧基活化，再将抗体与磁珠表面的羧基共价反应。这一类型的磁珠效果稳定，但制备过程略复杂。间接偶联法分两种模式：其一，磁珠表面偶联二抗，在通过二抗与特异性抗体的结合，将抗体间接偶联在磁珠上(Datta, et al., 2008 Chunglok, et al., 2011)；其二，磁珠表面偶联链霉亲和素，再与标记生物素的抗体结合，制备免疫磁珠(Zhu, et al., 2011)。这一制备过程简单，但获得的磁珠性能不稳定。目前在食源性病原微生物检测方面，主要是将免疫磁珠分离技术与显色培养基、PCR技术、免疫学技术、电化学技术或流式细胞技术等检测方法结合起来应用。Taha等(Taha, et al., 2010)将免疫磁分离技术与显色培养基检测集合起来进行鸡肉中沙门氏菌的检测，其检测限可至1.6CFU/mL。Cadirci等( ad rc , et al., 2010)将免疫磁分离技术与多重PCR结合起来分离牛肉样品中的大肠杆菌O157：H7
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言8图1-3 目前常用的几种RPA设备Fig 1-3 Several commonly used RPA devices1.3.2 RPA 的原理RPA的基本反应机制同活细胞体内的基因同源重组类似(图1-4)。标准RPA反应包括三种关键蛋白(重组酶UvsX、单链结合蛋白Gp32、链置换DNA聚合酶Bsu)和一种辅助蛋白UvsY。首先，UvsX蛋白在UvsY的辅助下与引物结合，形成核蛋白复合体，由此产生的复合物在双链DNA中搜索同源序列。一旦同源序列被定位，复合物即侵入双链DNA，形成D-loop型结构。在D-loop型结构一边，引物与模板链杂交，引发链置换反应。而另一边以单链DNA形式存在，单链结合蛋白Gp32结合在此单链上使其处于稳定状态(Yonesaki and Minagawa, 1985 Harris and Griffith, 1987)。随后，重组酶UvsX从核蛋白复合体上脱离
【参考文献】：
期刊论文
[1]食品中三种金黄色葡萄球菌检测方法的对比分析[J]. 胡路平,季昱. 食品安全导刊. 2018(15)
[2]采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中大肠杆菌O157[J]. 龙梦瑶,蒋蔚,陈永军,熊挺,陈芸,韩阳瑞,凌娇,孙卫东,王权. 畜牧与兽医. 2018(03)
[3]重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病原快速检测中的应用[J]. 吴耀东,徐民俊,郑文斌,冯胜勇,朱兴全. 中国兽医学报. 2016(10)
[4]上海市食源性金黄色葡萄球菌分布状况[J]. 李自然,施春雷,宋明辉,史贤明. 食品科学. 2013(01)
[5]金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法的建立及应用[J]. 王亚丽,蔡阳,刘韬,宋战昀,王宁,王振国. 中国生物制品学杂志. 2012(10)
[6]金黄色葡萄球菌生物被膜的控制方法研究进展[J]. 孙纪录,陈小雪,韩北忠. 中国酿造. 2011(06)
[7]Luminex液相芯片的发展及应用[J]. 谢冲,王国民. 复旦学报(医学版). 2010(02)
[8]液相芯片分析技术及其临床应用[J]. 林方,熊伟,祝庆余. 解放军医学杂志. 2009(04)
硕士论文
[1]高响应性磁性微球的制备及其生物分离应用[D]. 曹菁菁.天津大学 2009
本文编号：3116161
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于单壁碳纳米管检测及黄色葡萄球菌的传感器制备原理图
1.2.2 磁珠的应用1.2.2.1 细菌分离免疫磁珠分离技术被广泛应用于复杂基质中的细菌分离(图1-2)。磁珠偶联抗体的方式分为直接偶联法和间接偶联法。直接偶联法是指抗体共价结合在羧基磁珠表面。首先将磁珠表面上的羧基活化，再将抗体与磁珠表面的羧基共价反应。这一类型的磁珠效果稳定，但制备过程略复杂。间接偶联法分两种模式：其一，磁珠表面偶联二抗，在通过二抗与特异性抗体的结合，将抗体间接偶联在磁珠上(Datta, et al., 2008 Chunglok, et al., 2011)；其二，磁珠表面偶联链霉亲和素，再与标记生物素的抗体结合，制备免疫磁珠(Zhu, et al., 2011)。这一制备过程简单，但获得的磁珠性能不稳定。目前在食源性病原微生物检测方面，主要是将免疫磁珠分离技术与显色培养基、PCR技术、免疫学技术、电化学技术或流式细胞技术等检测方法结合起来应用。Taha等(Taha, et al., 2010)将免疫磁分离技术与显色培养基检测集合起来进行鸡肉中沙门氏菌的检测，其检测限可至1.6CFU/mL。Cadirci等( ad rc , et al., 2010)将免疫磁分离技术与多重PCR结合起来分离牛肉样品中的大肠杆菌O157：H7
中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言8图1-3 目前常用的几种RPA设备Fig 1-3 Several commonly used RPA devices1.3.2 RPA 的原理RPA的基本反应机制同活细胞体内的基因同源重组类似(图1-4)。标准RPA反应包括三种关键蛋白(重组酶UvsX、单链结合蛋白Gp32、链置换DNA聚合酶Bsu)和一种辅助蛋白UvsY。首先，UvsX蛋白在UvsY的辅助下与引物结合，形成核蛋白复合体，由此产生的复合物在双链DNA中搜索同源序列。一旦同源序列被定位，复合物即侵入双链DNA，形成D-loop型结构。在D-loop型结构一边，引物与模板链杂交，引发链置换反应。而另一边以单链DNA形式存在，单链结合蛋白Gp32结合在此单链上使其处于稳定状态(Yonesaki and Minagawa, 1985 Harris and Griffith, 1987)。随后，重组酶UvsX从核蛋白复合体上脱离
【参考文献】：
期刊论文
[1]食品中三种金黄色葡萄球菌检测方法的对比分析[J]. 胡路平,季昱. 食品安全导刊. 2018(15)
[2]采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中大肠杆菌O157[J]. 龙梦瑶,蒋蔚,陈永军,熊挺,陈芸,韩阳瑞,凌娇,孙卫东,王权. 畜牧与兽医. 2018(03)
[3]重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病原快速检测中的应用[J]. 吴耀东,徐民俊,郑文斌,冯胜勇,朱兴全. 中国兽医学报. 2016(10)
[4]上海市食源性金黄色葡萄球菌分布状况[J]. 李自然,施春雷,宋明辉,史贤明. 食品科学. 2013(01)
[5]金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法的建立及应用[J]. 王亚丽,蔡阳,刘韬,宋战昀,王宁,王振国. 中国生物制品学杂志. 2012(10)
[6]金黄色葡萄球菌生物被膜的控制方法研究进展[J]. 孙纪录,陈小雪,韩北忠. 中国酿造. 2011(06)
[7]Luminex液相芯片的发展及应用[J]. 谢冲,王国民. 复旦学报(医学版). 2010(02)
[8]液相芯片分析技术及其临床应用[J]. 林方,熊伟,祝庆余. 解放军医学杂志. 2009(04)
硕士论文
[1]高响应性磁性微球的制备及其生物分离应用[D]. 曹菁菁.天津大学 2009
本文编号：3116161
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